向日葵xan1突变体幼苗早期生长发育与叶绿体发生的变化外文翻译资料

向日葵xan1突变体幼苗早期生长发育与叶绿体发生的变化

原文作者M.FAMBRINI, G.CIONINI, N.RASCIO, F.DALLA VECCHIA, and C. PUGLIESI,

单位 比萨大学农业植物生物学系

摘要：在向日葵(Helianthus annuus L.)xan1突变体中, 对器官解剖及幼苗生长的影响并关联到叶绿体生源论的变更。生长在165 mu;mol(photon) m^–2 s^–1的xan1突变体中，子叶和叶片叶绿体超微结构发生了严重的改变。在xan1突变体中的子叶横切面或澄清组织与正常子叶相比没有明显的改变，说明在子叶中叶绿体的生物合成的损害可以忽略不计。对比分析在黄原胶1中的叶，表明叶绿体生物合成缺陷大幅减少，器官大小和毛状体的生长明显增强。栅栏组织与海绵组织的分化在子叶和xan1突变体叶片均正常，但对野生型的质体数量来说这两类组织大幅减少。此外，与正常苗和初生根的一个矮小的中柱维管束相比，xan1中的苗下胚轴维管束的发育有明显的减缓。在体外供给蔗糖不足以恢复xan1下生长的亏损和形态发生过程的约束。

关键词：叶绿体超微结构； 向日葵； 体外培养；色素缺失突变株；毛状体发展

引言叶绿体是外膜和内膜包被的透镜形细胞器，尤其是在光合叶片的栅栏组织。在内部，一个三维光合膜装置布置在基质或基粒类囊体型的质体类型（(Mustaacute;rdy and Garab 2003）上。叶绿体的生物学特性是一个非常重要的课题，对植物生命的研究具有重要意义。绿色质体是内共生体形成的，不仅需要通过光合作用过程的正碳平衡，而且还需要的氨基酸和脂肪酸，激素，维生素，以及许多其他的代谢物的生物合成(Neuhaus and Emes 2000)。叶绿体的复杂功能需要两个基因组物理分离成质体和细胞核的参与(Gray et al. 2002)。核会影响叶绿体基因的表达，反过来，叶绿体也可以通过光合作用相关蛋白表达来调节核基因编码(Gray et al. 2002)。

根据叶绿体发育的缺陷在某些突变体叶片的组织特性，提出了一个模型，一个假定的在叶肉间运作用以传播叶绿体的发育状况有关信息的质体核信号通路(Keddie et al. 1996)。当质体发育受损，叶肉解剖结构出现异常导致特别的变异造成栅栏细胞死亡(reviewed in Rodermel 2001)。信号转导通路相关的栅栏细胞发展和逆行信号（叶绿体到核）控制的核基因的表达，可能是不一样的，因为在有缺陷的叶绿体和叶可变突变体的番茄，叶片形态建成的质体调节是特殊受损的(Bellaoui et al. 2003)。Bellaoui and Gruissem (2004)表明，器官发育必不可少的化合物是由早期开发的质体产生的；但是这种信号的性质仍是未知。栅栏组织细胞通常排列成行与柱状，有利于辐射将光合作用最大化。海绵薄壁细胞中的细胞形态和大小更为多变，一个显眼的胞间空间系统是这些组织的特殊特征。叶解剖取决于以下几个因素，如辐照度(Yano and Terashima 2004) ，激素含量(Barrero et al. 2005)，生长生境(Ramesar-Fortner et al. 1995)，光敏反应的敏感性(Cookson et al. 2003),细胞活动周期(Dewitte and Murray 2003)，营养失衡(Henriques et al. 2002)。此外，还发现异常的叶肉细胞体系结构有对臭氧增加敏感性的特点(Gonzaacute;lez-Bayoacute;n et al. 2006)。依据叶绿体的发育状况和叶片形态之间的关系，得到了两类突变体的研究：叶斑和白化植物。第一种类型通常是由叶片表现出绿色和白黄区域的明显基因型特征组成的(Sakamoto 2003, Aluru et al. 2006)。白化突变体通常是致命的，在他们的子叶或真叶的光合色素含量急剧减少(Somerville 1986)。

质体的代谢状况是如何在其他类型的基因型与核质体蛋白基因的突变上影响幼苗生长发育和生长的还需要深度的评估。在这种情况下，拟南芥的淡水芹突变体与淡绿色的表型是例子之一(Holding et al. 2000)。在xan1变体中向日葵的超微结构的异常，如保存几个巨型叶绿体和相当大量的质体色素与相应特点的白色部门在斑叶的植物或白化突变体相比两种性状是非常不同的(Fambrini et al. 2004)。评价植物的生长和器官组织学的不同方面，我们评估如果在观察到xan1突变体叶绿体的异常生物发生耦合到幼苗形态发生了重大变化。

材料与方法

植物的生长：瘦果纯合子（XAN1/XAN1）和杂合子（XAN1/xan1）自花授粉植物发芽在黑暗中在25°C在培养皿中，用蒸馏水润湿滤纸。3天后，萌发的种子被转移到8cm直径花盆的土壤和沙子的混合物。幼苗生长12天，在生长室中，在25°C的16小时的“白光”。辐照度为165mu;mol(photon) m–2 s–1由冷白荧光灯提供(Philips TLD 36W/33, Philips, Eindhoven, The Netherlands). 根系的生长被用来做为幼苗的成长评估，将瘦果置于两片滤纸片间放在含有的矿物质营养的蒸馏水的树脂玻璃框架中浸没(Lenzi et al. 1995)。经过12 天的培养，收集每一根系统，吸干两片滤纸，并在10秒内使用电子天平称量 (plusmn;0.1 mg)。

组织的澄清：子叶和叶片组织从12日龄的幼苗离体，并用氢氧化钠和水合氯醛法清理，这个方法来自Ruzin (1999)。组织用5%（m/v）氢氧化钠处理，然后用一半强度的商业漂白剂漂白5–10分钟。澄清是在水合氯醛24°C下处理24小时。植物在蒸馏水冲洗几次,然后安装光学显微镜(Wild Makroskop M420, Herbrugg, Switzerland)。

光和透射电子显微镜：子叶和叶外植体从12日龄幼苗叶片的中央部分切除并立即在4°C 3%（m/v）0.1 M维罗那缓冲戊二醛(pH 6.9)固定过夜,之后在相同的缓冲区和相同的温度的1%（M / V）四氧化锇下固定2小时。标本在一系列乙醇和环氧丙烷下脱水后再用环氧树脂包埋。用75%（v/v）酒精脱水的同时进行醋酸铀染色。部分用超薄切片机切片(Ultracut, Reichert-Jung, Vienna, Austria)。光镜下薄片(1 mu;m 厚)被基本甲苯胺蓝染色[1%(m/v) 甲苯胺蓝和 1%(m/v) 四硼酸钠 1:1 的体积]，用另一个光学显微镜检查(Ortholux, Leitz, Wetzlar, Germany)。对于透射电子显微镜，超薄部分(厚0.06mu;m)沾柠檬酸铅用透射电子显微镜观察(TEM300, Hitachi, Tokyo, Japan)并在75千伏条件下操作。从12日龄的苗中收集下胚轴和根外植体。在中位区域获得下胚轴的采样，从颈部下切除0.5-1cm的根部。材料在FAA（甲醛/冰醋酸/乙醇/蒸馏水、10：5：50：35，V / V / V / V）下保存24小时后，转移到70%(v/v)酒精中(Fambrini et al. 2006)。石蜡包埋后用旋转式切片机切片(Reichert, Vienna, Austria)。横向部分(10mu;m厚)在1%(m / v) 番红和0.2%(m / v)固绿染色后并用光学显微镜进行检查(DMRB, Leitz, Wetzlar, Germany)

环境扫描电子显微镜分析：利用环境扫描电镜对新鲜叶片进行了观察(ESEM) XL30 TMP Philips (Philips, Eindhoven, The Netherlands) 在15 kV and 1.067times;102 Pa下操作.

体外培养：赤裸的瘦果的野生型 (WT) 和 xan1 突变体在2.8 % (v/v)次氯酸钠溶液[含0.01 % (v/v) Triton X-100]中消毒 20 分钟，然后在无菌蒸馏水漂洗几次。瘦果发芽并种植在细菌用琼脂上凝固(8 kg m–3)（Oxoid Ltd., Basingstoke, UK)30天，MS培养基(Murashige and Skoog 1962) 中含蔗糖(30 kg m–3)，在25°C，16小时的光照下培养。冷白荧光灯提供的辐照度是 15 mu;mol(photon) m-2 s-1 (Philips TLD 36W/33)。诱导产生不定根，单个节点扦插从10日龄微繁殖植株切下并立即在三角烧瓶中进行子培养，其中为新鲜含蔗糖(30 kg m–3) 但不含激素的MS培养基(Fambrini et al. 2004)。30天培养后对不定根的诱导进行评价。取一周龄的苗进行下胚轴切段，长1cm。外植体立即用电子分析天平(plusmn;0.1 mg)称重并立即转移到凝固的含1 gm^–3 N6 -苄基腺嘌呤 (BAP) 和 1 gm^–3 1-萘乙酸(NAA)MS基本培养基上诱导愈伤组织增值。在16小时光照条件[15 mu;mol(photon) m–2 s –1]下培养30天后，外植体进行称重。相对于初始的外植体质量用百分比来计算质量增量以评估愈伤组织的生产。

对所有性状进行统计分析。报告的值是从三个独立的实验，每个实验重复20次（苗和/或外植体）得到的。通过学生的t检验对平均值之间的差异进行了测试，无论是0.05或0.01，都是意义重大的。平均值在反正弦变换后按百分比来表示进行统计评估。

结果

子叶储藏物质枯竭后，xan1突变体就会死亡，因此植物生长的评价及形态分析会在生长早期阶段（如12日龄的苗）或体外（在含蔗糖的 MS 培养基上生长了30天的植物）。突变体的幼苗很容易在色素缺乏表型的基础上导致体内受损（图1A)。在12天的发育期后，在165mu;mol(photon) m^–2 s^–1的辐照度下，xan1突变体的特点是小的真叶（图1b），较短的下胚轴，子叶比WT矮小（表1）。

表1. 野生型的表型性状和黄原胶1向日葵幼苗种在12天165mu;mol l(photon) m^–2s ^–1辐照度的生长室中。根据学生的t检验，分别用*或 **来比较xan1突变体和WT在0.05和0.01不同水平的意义。

用电子显微镜分析了生长在165 mu;mol(photon) m^–2 s ^–1下幼苗的子叶和叶片，用来评价 xan1 突变对叶绿体超微结构和类囊体膜组织的影响。在12日龄的子叶WT苗中，叶绿体类囊体系统表现出良好的组织和均匀的基质（图1C）。相比之下，相同的光照条件下生长在xan1的幼苗子叶显示出严重的类囊体膜损失（图 1D）。较好的形状和有组织的叶绿体在用r 165 mu;mol(photon) m–2 s –1培养的 12日龄的WT苗中出现（图1E）。xan1幼苗的叶绿体形状不规则，与异常的类囊体堆叠杂乱无章地分布在不均匀的基质中。他们表现出这些类囊体杂乱的堆叠在基质中和电子致密的液滴可能由拆卸类囊体膜脂质和蛋白质聚集(Simidjiev et al. 1998) (图1F)。

通过横切的子叶、叶片、 下胚轴和165 mu;mol(photon) m^–2 s^–1下生长的幼苗根部的分析了 xan1 突变对幼苗解剖结构的影响。在子叶和xan1的叶片中，栅栏组织和海绵组织的组织的重量是不同的（图2D和H分别与图2C和G比较）。然而，xan1的两个器官的细胞显示质体数量相对于重量大幅减少（图3B和D分别与图3a和C比较）。在子叶和突变体叶片（图2A，B，E，F）的血管模式（网状脉序）和程度并非异常，但在叶背面xan1镰刀形的毛状体比在WT(图 4A–D)更长。xan1下胚轴的主维管束比在WT中的显著减少（图5A，B）。此外，一个矮小的中柱具有突变的初生根的重量（图C，D）

图1.A：一个xan1/xan1杂合子后代向日葵幼苗。该xan1/xan1苗色素缺乏。 B：生长在辐照度165 mu;mol(photon) m^–2 s^–1的12日龄幼苗xan1突变体叶片的（顶部）和野生型（底部）。 C-F：在野生型子叶叶绿体超微结构（C）和叶（E）以及从12日龄相同光强下生长的幼苗的xan1子叶（D）和叶（F）。Bars = B: 4.8 mm; C: 0.4 mu;m; D: 0.5 mu;m; E: 0.55 mu;m; F: 0.60 mu;m. 箭头=类囊体堆叠；双箭头=电子致密颗粒。

在xan1突变体的净CO2同化速率是零并且幼苗在子叶期死亡(Fambrini et al. 2004, Guidi et al. 2006)。因此，为了研究植物生长后期阶段，采用在体外进行实验。尽管存在的外源性蔗糖的突变体幼苗表现出减幅的增长，无论是叶片数还是总干物质（表2）。值得注意的是，可以区分xan1下胚轴不定根是相对于重量减少（表2）。相反，在下胚轴愈伤组织生产检测基因型之间无显著性差异（表2）。

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