美伐他汀是HMG-CoA还原酶抑制剂，可减轻中风损害并上调小鼠内皮型一氧化氮合酶外文翻译资料

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美伐他汀是HMG-CoA还原酶抑制剂，可减轻中风损害并上调小鼠内皮型一氧化氮合酶

Sepideh Amin-Hanjani, 医学博士; Nancy E. Stagliano, 博士；

Masaru Yamada, 医学博士; Paul L. Huang, 医学博士, 博士；

James K. Liao, 医学博士; Michael A. Moskowitz, 医学博士

背景和目的：3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂（他汀类药物）降低血清胆固醇并降低中风和心血管疾病的发生率。越来越多的证据表明，他汀类药物可发挥某些有益作用，而与降低胆固醇无关。确实，我们以前已经证明了慢性辛伐他汀的给药会上调内皮一氧化氮合酶（eNOS），从而在鼠类脑缺血模型中产生更多的功能蛋白，增加脑血流量和神经保护作用。在本报告中，我们检查了他汀类药物家族的其他成员是否也具有这些作用，以及长期治疗是否能持续维持eNOS的上调。

方法：使用细丝模型，在2小时大脑中动脉闭塞之前，对18-22 g的雄性小鼠给药美伐他汀（每天2 mg / kg或20 mg / kg），持续7天、14天、28天。 （n=9~12）。在24小时间评估神经功能缺损和脑梗塞体积。监测了一部分动物的动脉血压和气体，相对脑血流量以及血胆固醇水平（n=5）。通过[¹⁴C]碘苯丙胺指示剂分级技术（n=6）测量绝对的脑血流量。确定了eNOS mRNA和蛋白质水平。

结果：美伐他汀以剂量和时间依赖性方式增加eNOS mRNA和蛋白质的水平，减小梗塞面积并改善神经功能缺损。14天和28天大剂量治疗可达到最大的保护作用（分别减少26％和37％的梗塞）。胆固醇水平仅在治疗28天后才降低，并且与梗死的减少无关。14天大剂量治疗后，基线绝对脑血流量增加了30％。

结论：美伐他汀对慢性预防性治疗可上调eNOS并增加脑血流量。这些变化发生在血清胆固醇水平无变化的情况下，持续治疗长达1个月，并导致大脑中动脉闭塞后的神经保护。(Stroke. 2001;32:980-986.)
关键词：脑缺血，内皮一氧化氮合酶，HMG-CoA还原酶抑制剂，小鼠

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂（他汀类药物）的公认作用是通过阻断甲羟戊酸酯的合成来降低胆固醇的生物合成。鉴于高胆固醇血症患者心血管疾病的高发率，他汀类药物是降低胆固醇的广泛处方药物。

在临床试验中，他汀类药物降低了心血管和脑血管事件的发生率，即使胆固醇水平正常或平均的患者，其心肌梗塞或中风的风险也降低了。临床和实验证据表明，他汀类药物具有以下特点：除降低胆固醇外，还有其他有益的作用。例如，HMG-CoA还原酶抑制作用可改善仅治疗1个月的患者的血管内皮依赖性冠状血管舒张作用，然后才使血清胆固醇水平显着降低。此外，他汀类药物可增加动物的纤溶活性，从而强烈暗示这些抑制剂可发挥作用通过快速作用，不依赖胆固醇的机制产生其他有益作用。

我们报道了包括辛伐他汀和洛伐他汀在内的他汀类药物可上调内皮一氧化氮合酶（eNOS）并增强脑血流量（CBF）。此外，两种他汀类药物在预防性给药时均能保护大脑免受实验性中风的侵害，而不会降低血清胆固醇。该机制是eNOS依赖性的，因为他汀类药物不能减少eNOS缺陷小鼠的组织损伤。

在本研究中，我们使用美伐他汀来证明他汀类作为一般类别可增加eNOS mRNA和蛋白质水平并预防中风损害。我们还显示，与先前报道的他汀类药物相比，美伐他汀具有不同的药效。通过改变治疗的持续时间和剂量，我们能够建立药物治疗窗口，并且我们确定每日服用美伐他汀1个月后不会出现速激肽。最后，我们确定增强的eNOS mRNA和蛋白表达与美伐他汀在缺血性脑中的保护作用相对应。

材料和方法

药物制剂
如前所述，将美伐他汀（Compactin，Sigma）通过碱水解进行化学活化。通过真空离心法制备美伐他汀粉末；将药物在0.1mol / L磷酸盐缓冲液中复溶，并将pH值调节至7.4。
药物管理

每天使用2或20 mg / kg剂量的美伐他汀或相应浓度的媒介物处理野生型129-SV / eVTAcBr雄性小鼠（Taconic Farms；体重18-22 g）和eNOS缺陷型雄性小鼠（体重18-22 g），持续7天、14天、28天。该药物通过皮下植入的7天或14天ALZET微型渗透泵（Alza Scientific Products）输送。更换泵一次，进行28天的治疗。
局灶性脑缺血模型
使用先前描述的腔内细丝方法（每组n=9~12）对动物进行短暂的2小时大脑中动脉闭塞（MCAO）。简而言之，将小鼠用2％的氟烷麻醉并保持在1％氟烷，70％一氧化二氮和30％氧气（通过面罩）。将一条11毫米硅胶涂层的8-0尼龙单丝引入颈外动脉，进入颈内动脉，并前进至大脑前动脉，从而遮挡大脑中动脉（MCA）的起源。缺血区域中心的激光多普勒血流仪（Perimed）用于评估相对脑血流（rCBF）的变化。在小型动物孵化器中放置2小时后，将动物重新麻醉，并去除细丝。在外科手术过程中，小鼠通过温度控制单元（FHC）保持在36°C至37°C的核心体温下。对于一部分动物，将左股动脉插管以进行动脉血压测量和动脉血气分析（Corning 178，CIBA-Corning Diagnostics）。对于这些动物，在整个缺血过程中以及再灌注后的15分钟内监测rCBF。
神经系统缺陷
如先前所述，由对治疗组不知情的观察者在缺血2小时和再灌注22小时时以0（无缺陷）至3（严重缺陷）的等级对小鼠进行神经功能缺损测试。
梗死评估
在灌注后的二十二小时，杀死小鼠，并迅速移出大脑。使用小鼠脑基质（RBM-2000C；哈佛仪器）制备前脑的两毫米厚的冠状切片。在室温下，将切片用溶于0.1mol / L，pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水中的2％2,3,5-三苯基四唑氯化物（Sigma）染色15分钟，然后在10％福尔马林缓冲液中固定过夜。由对治疗不知情的实验者使用图像分析系统（M4，Imaging Research）对梗塞体积进行定量。通过将各部分的梗塞体积相加直接计算梗塞体积，或通过从对侧半球减去未受损的同侧半球的体积间接计算出脑梗塞以间接纠正脑水肿。

绝对CBF测量

鉴于先前已证明他汀类药物对小鼠的CBF有影响，因此我们对一小群小鼠进行了慢性治疗后的研究。用美伐他汀（20 mg / kg）或媒介物治疗的小鼠子集（每组n=6）用于通过[¹⁴C]碘苯丙胺指示剂分级分离技术测定基线绝对CBF。如所述麻醉，通风和监测小鼠。麻醉稳定后三十分钟，如所述测定CBF。

胆固醇测量

在使用安乐死之前，使用Sigma Diagnostics胆固醇试剂盒（步骤No. 352，Sigma Diagnostics）和推荐的胆固醇校准剂（No. C0534），从安乐死前从小鼠眼眶抽取的血液中定量血清总胆固醇水平分析。

半定量逆转录-聚合酶链反应

从用于梗塞测量的同一组动物中快速收获主动脉，冷冻在液氮中，并保存在280°C下直至使用。收集主动脉是因为先前已显示出主动脉eNOS水平升高与脑eNOS水平升高相关。如前所述，对eNOS进行了总RNA分离，逆转录（RT）和半定量竞争性聚合酶链反应（PCR）。有义引物（5rsquo;-TTCCGGCTGCCACCTGATCCTAA-3rsquo;）和反义引物（5rsquo;-AACATATGTCCTTGCTCAAGGCA-3rsquo;）引物扩增出了一个340-bp的鼠eNOS片段。

免疫印迹分析

安乐死后从小鼠中迅速收获主动脉，冷冻在液氮中，并保存在280°C下。将来自美伐他汀（20 mg / kg）或媒介物处理过的动物的合并主动脉（n=2）在冰冷的放射免疫沉淀测定裂解缓冲液中匀浆，并测定总蛋白质。通过10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳从每个样品中分离20微克总蛋白。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜（BioRad）上，并在5％牛奶/ Tris缓冲盐水/0.05% Tween 20中于4°C封闭过夜。使用浓度为1:200的多克隆抗体（Transduction Laboratories）检测eNOS蛋白。化学发光系统（ECL，Amersham Pharmacia Biotech）用于曝光柯达放射自显影胶片。为了确保整个样品上的蛋白质负载相等，用抗微管蛋白的单克隆抗体再次探测膜。

统计分析

数据表示为平均值plusmn;SEM。统计分析使用未配对的样品检验或Bonferroni事后比较的ANOVA（涉及2组以上）。 低于0.05的概率值被认为具有统计学意义。

结果

减少脑梗塞

他汀类药物治疗的剂量和持续时间各不相同，以评估对脑损伤的作用。在治疗14天或28天后，2mg/kg剂量的美伐他汀未能显著减少梗塞体积（图1）。与媒介物相比，以20 mg / kg的剂量治疗14天和28天，分别成功地减少了26％和37％的伤害（图1）。相反，7天的预处理不足以缩小梗塞面积。校正脑水肿并没有改变结果（间接；分别降低25％和36％）。由于先前已有报道称辛伐他汀治疗未能保护eNOS缺陷型小鼠免受中风损害，因此，我们仅对突变体使用最大剂量（20 mg / kg美伐他汀）。与野生型小鼠的经历不同，预处理后梗塞面积没有明显减少。

神经系统缺陷

缺血2小时后，经媒介物处理的动物表现出中度至严重的神经功能缺损，例如盘旋和扶正反射丧失。到24小时，轻度到中度的缺陷持续存在。用20mg/kg美伐他汀治疗的动物在2和24小时的神经学评分均高于用赋形剂治疗的小鼠（Plt;0.05）。

生理参数

在用20mg/kg美伐他汀或媒介物处理14天的动物中评估生理参数。在药物治疗组和赋形剂组之间，血压、PaCO₂，PaO₂、pH值无明显差异（表1）。为了减少组织学结果差异是由于缺血性损害程度的改变而引起的可能性，在缺血前、缺血中和缺血后对rCBF进行监测。溶媒和治疗组之间的缺血内rCBF降低和缺血后再灌注水平相当，表明缺血的相对深度和持续时间相当。

血清胆固醇水平

用2或20mg/kg的剂量治疗28天后，总血清胆固醇水平降低。但是，在治疗7或14天后，血清胆固醇并未降低（表2）。先前的报道还显示，他汀类药物给药2周后，对实验动物的胆固醇水平没有影响，但随着疗程的延长（4周），血清胆固醇水平降低了。

eNOS上调

通过RT-PCR和Western印迹评估美伐他汀对eNOS信使RNA和蛋白质的作用。 在每天使用20mg/kg的治疗下，14天后，观察到eNOS mRNA的增加（图2A和2B）。为了确定这种作用的时间依赖性，在每天给药20 mg/kg后的第7、14和28天比较eNOS mRNA。 eNOS mRNA在14天和28天时显着增加（Plt;0.05）（图2C和2D）。 此外，在使用20mg/kg处理14天后，通过免疫印迹检测到eNOS蛋白增加了2倍（图3）。

绝对CBF

与媒介物治疗动物的基础CBF（63plusmn;3 mL / 100 g /分钟）相比，慢性美伐他汀治疗（20 mg/kg，14天）的CBF与基础CBF相比提高了30％，达到每分钟82plusmn;4 mL/100 g（Plt;0.05）。

讨论

化学类他汀类药物可增加eNOS mRNA和蛋白水平，减少梗塞体积，并减少非动脉粥样硬化，降血脂正常小鼠的神经功能缺损。本实验中使用的家族成员美伐他汀（化学名称紧密蛋白），当每天以20mg/kg的剂量服用14天时，可以保护大脑。只要获得神经保护，eNOS mRNA水平就会增加。此外，在每天治疗28天后，美伐他汀继续增加eNOS的表达并保护缺血性脑，从而抑制速激肽的分泌。实际上，减少梗塞的作用可能已经增强。但是，无论治疗时间长短，给予较低剂量（每天2mg/kg）的美伐他汀都不会增加eNOS或防止缺血性损伤。

他汀类药物对急性中风的治疗不需要降低血清胆固醇。预处理28天后血清胆固醇降低，而eNOS上调时14天后梗死减少（图1）。此外，对他汀类药物所致的中风治疗无效的eNOS缺陷小鼠仍表现出降低的血清胆固醇水平，其水平与其野生型小鼠相似。

使用NO前体或供体可减少大鼠MCAO后的梗死面积并增加CBF。他汀类药物的机制似乎与之相关。美伐他汀导致eNOS mRNA和蛋白质水平增加，绝对CBF增加。CBF升高可能是由于血管阻力降低，也可能反映了NO依赖性机制导致的血小板聚集和或白细胞粘附降低。其他NOS亚型的作用似乎不太可能，因为当NO及其衍生物分子通常被视为神经毒素时，尽管在脑实质内大量生成，但仍有少数例外。此外，他汀类药物选择性上调eNOS亚型。因此，有证据表明，他汀类药物的神经保护作用主要是血管而非神经元机制。其他他汀类药物的作用也可能是相关的，例如纤维蛋白溶

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