槐果碱靶向miR-21抑制头颈癌进展并逆转其上皮间充质转化表型外文翻译资料

槐果碱靶向miR-21抑制头颈癌进展并逆转其上皮间充质转化表型

Wei Liu^1,2,5,Beilei Zhang^3,5,Guo Chen^4,5,Wenjiao Wu¹,Lin Zhou¹,Yaru Shi¹,Qi Zeng¹,Yanqiu Li⁴,Youwei Sun⁴,Xingming Deng⁴,and Fu Wang¹

¹西安电子科技大学生命科学与技术学院教育部分子与神经影像工程研究中心, 陕西 西安 710071;²第四军医大学西京医院肝胆外科，陕西 西安 710032；³第四军医大学唐都医院妇产科，陕西 西安 710038；⁴放射肿瘤学系，埃默里大学医学院和 Winship 癌症研究所，埃默里大学，亚特兰大，GA 30322，美国

摘要：癌症化疗的一个主要挑战是开发安全且有效的临床化疗药物。槐果碱 (SC) 是一种来自Sophora alopecuroides L的天然存在的四环喹唑啉生物碱，具有低毒性。SC目前已展示出有前景的治疗特性，包括抗炎、抗疼痛和抗病毒活性。然而，SC 的抗肿瘤功效及其潜在机制尚未完全阐明。在本研究中，研究了 SC 对头颈部鳞状细胞癌 (HNSCC) 进展的抑制作用以及该作用涉及 microRNA-21 (miR-21) 调节的可能机制。通过细胞活力、Transwell 和伤口愈合实验，我们表明 SC 有效抑制了 HNSCC 细胞的增殖、侵袭和迁移。而且，SC 通过阻断 Dicer 介导的 miR-21 成熟，通过下调 miR-21 表达发挥其生长抑制作用。 此外，SC 治疗导致 PTEN 和 p38MAPK 磷酸化的表达增加以及上皮间充质转化 (EMT) 的逆转，这被细胞中 miR-21 的异位表达所挽救。值得注意的是，在 HNSCC 的小鼠异种移植模型中，SC 显著抑制了肿瘤生长，而没有可观察到的组织细胞毒性。我们的研究结果为 SC 作为 HNSCC 癌症治疗的领先天然药物提供了临床前概念证明。

关键词：EMT；肿瘤治疗；MIR-21；p38MAPK；槐果碱

介绍

头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是全球第六大致命恶性肿瘤，全球每年约有 650,000 例新病例和35万例HNSCC相关死亡。¹ 尽管HNSCC治疗在过去30年中取得了巨大的医学进步，但由于第二原发肿瘤复发，患者的总生存率并没有显着提高。² 因此，了解HNSCC 进展背后的分子事件可能会揭示HNSCC的新治疗靶点。

近年来，具有潜在抗肿瘤特性的天然药物在癌症预防和治疗中受到了更多的关注。许多源例如微生物、真菌和植物的天然药剂已用于临床或临床试验。³ 抗癌药物的经典例子包括西他滨（第一种来自海洋的药物）和紫杉醇（来自中国太平洋紫杉属植物）。其他微生物来源的药物包括阿霉素、放线菌素D、博来霉素和丝裂霉素C。⁴ 这些药物具有多种机制，包括干扰肿瘤血管生成、侵袭和转移、靶向癌症干细胞、调节表观遗传修饰和介导 microRNA 表达。⁵

槐果碱(SC)是一种四环喹唑啉生物碱，是苦参中含量最丰富的活性成分之一。先前的研究表明，SC具有多种药理作用，包括免疫调节、抗炎和抗疼痛活性。⁶ 此外，研究发现SC通过激活AMPK信号通路减轻肝细胞脂肪变性，并通过核因子 kB (NF-kB) 失活保护心肌功能免于缺血再灌注。^7,8 然而，SC对HNSCC的抗肿瘤活性及其潜在机制知之甚少。

MicroRNA (miRNA) 是小的非编码 RNA，通过与其目标mRNA的不完全配对来调节基因表达从而导致 mRNA切割或翻译抑制。大约22 nt的成熟miRNA 是从初级miRNA (pri-miRNA)的转录产生的，然后通过Drosha和Dicer酶的切割加工前体miRNA (pre-miRNA)。⁹ miRNA在多种生物过程中发挥着至关重要的作用，从细胞增殖、分化和凋亡到代谢和衰老。¹⁰ 此外，miRNA的异常表达谱与不同种类的人类癌症相关，表明 miRNA 可能起到致癌基因或抑癌基因的作用。¹¹ miR-21 是许多不同类型的人类癌症中最显着过表达的miRNA之一，包括乳腺癌、胃癌、结肠癌和头颈癌。¹² 据报道，miR-21可以通过靶向多种抑癌基因，包括PTEN和PDCD4，促进癌细胞的增殖、侵袭和转移。^13,14 因此，靶向 miR-21 并调节其活性可能为癌症治疗开辟一条有希望的途径。

在本研究中，我们证明SC能够通过阻断Dicer催化的miR-21成熟和参与 p38MAPK 信号通路来抑制HNSCC细胞的增殖、迁移和侵袭。此外，S有效地促使癌细胞中上皮间充质转化（EMT）的逆转并抑制体内HNSCC的生长。我们的结果表明，SC 可能是通过靶向 miR-21 表达来治疗 HNSCC 的潜在先导化合物。

结果

SC抑制HNSCC细胞增殖、侵袭和迁移

本研究在UM-SCC-22B和UM-SCC-47两种细胞系中测定了SC的抗肿瘤活性。首先，细胞用不同浓度的SC处理（图1A)48小时，然后使用CCK-8测定分析细胞活力。如图所示图1B，SC显示出细胞增殖的剂量依赖性抑制。UM-SCC-22B 或 UM-SCC-47 细胞中 SC 的半数最大浓度IC50是分别为1.067 mu;M或1.536 mu;M。

随后，我们通过Transwell 实验检测了SC对UMSCC-22B和UM-SCC-47细胞侵袭的影响。洗涤Transwell 底面上的结晶紫染色的细胞，并在595 nm的光密度(OD)下进行定量。SC处理细胞的侵袭率以剂量依赖性方式低于DMSO处理细胞的侵袭率（图1C）。在增加SC处理浓度后，在伤口划痕试验中也可以观察到相同的细胞迁移抑制趋势（图1D)。总之，这些结果表明SC对肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭表现出有希望的抑制活性。

SC下调HNSCC细胞中miR-21的表达

越来越多的证据表明，天然药物通过许多不同的机制发挥其抗肿瘤活性，其中之一是通过调节miRNA的表达。所以我们试图弄清楚miRNA是否可以参与SC治疗的肿瘤细胞反应。我们选择几种已知的促癌或抑制肿瘤的miRNA，¹⁵包括 miR-15a、miR-34a、miR-10a、let-7a、miR-21、miR-99a、miR-9、miR-124a 和 miR-155 进行测试。实时定量PCR实验用以检查SC处理和未处理的HNSCC细胞中的miRNA表达谱。（图2A和2B)。有趣的是，与未经处理的细胞相比，一些测试的miRNA被下调，而一些 miRNA在SC处理的细胞中几乎没有变化。值得注意的是，在筛选的9种 miRNA 中，miR-21在两种细胞系中对SC治疗显示出最显著的下调趋势。为了排除 SC 对 miR-21 进行非特异性调节的可能性，我们用另外 10 种天然药物处理细胞，使用实时PCR检测发现这些药物对miR-21表达没有明显影响（图 S1A）。这些结果表明SC倾向性地降低HNSCC细胞中miR-21的表达。

为了进一步确定SC对 miR-21表达水平的影响，UM-SCC-22B 和 UM-SCC-47 细胞用不同浓度的SC（1 mu;M、2 mu;M 和 4 mu;M）刺激24小时，然后进行实时PCR。如图所示图2C，用SC处理以剂量依赖性方式降低miR-21表达水平，表明SC确实可以下调 HNSCC细胞中的miR-21表达。更重要的是，miR-21模拟物和SC的联合治疗挽救了4mu;M SC单独诱导的肿瘤细胞活力（图2D)、侵袭(图2E), 和迁移 (图2F) 的抑制效应。总之，这些数据表明 SC 可以通过下调 miR-21表达来抑制HNSCC细胞增殖、侵袭和迁移。

SC通过阻断Dicer加工来抑制miR-21

基于SC对miR-21表达的抑制作用，我们想评估pre-miR-21或pri-miR-21表达是否发生变化。如图所示图 3A，在两种细胞系中，SC处理后pre-miR21的表达水平以剂量依赖性方式增加，表明SC可能通过阻碍Dicer将pre-miR-21裂解为成熟miRNA来抑制 miR-21。为了进一步验证该假设，我们在体外Dicer阻断试验中监测了Dicer处理 pre-miR-21到成熟miR-21的扰动。在存在增加浓度的SC或不存在SC的情况下，将 pre-miR-21与Dicer一起孵育。如图所示3B，SC导致miR-21成熟的剂量依赖性降低，表明SC可能与pre-miR-21结合，从而阻止Dicer加工。此外，SC治疗导致 pri-miR-21表达的剂量依赖性降低，表明SC通过抑制pri-miR-21表达上调pre-miR-21（图 S1B）。

为了验证SC作用于Dicer上的pre-miR-21的潜在结合位点，合成了野生型和两点突变的pre-miR-21寡核苷酸（Mut1 和 Mut2）（图 3C)。 然后转染到细胞系中进行实时 PCR检测。与对照组相比，所有转染组中pre-miR-21的表达均增加。然而，与对照相比，仅在野生型组中检测到成熟 miR-21 的上调，而在 Mut1 或 Mut2 组中未检测到（图 3D)。这些结果表明pre-miR-21上的Dicer结合位点的点突变阻碍了Pre-miR-21的Dicer裂解为成熟的 miR-21。

为了进一步研究 SC 是否通过特定阻断Dicer加工来抑制miR-21表达，我们采用 Block-iT Dicer siRNA 池试剂盒针对 Dicer（si-Dicer，ThermoFisher）来敲低 UM-SCC-22B 和 UM- SCC-47细胞(图 3E)。此外，si-Dicer转染细胞中成熟的miR-21表达降低（图 3F）。然而，SC与si-Dicer处理的组合未诱导miR-21表达的协同抑制，表明SC通过Dicer功能处理下调 miR-21。

P38MAPK参与SC介导的肿瘤细胞进展抑制

鉴于PTEN是经miR-21验证的靶标之一，在HNSCC中具有重要作用，^14,16 我们研究了SC处理后PTEN的表达水平。正如预测的那样，SC显着增加了PTEN在UM-SCC-22B和 UM-SCC-47细胞中的蛋白质表达水平（图4A和4B)。此外，SC上调了PCDC4的蛋白质表达，PCDC4也被发现是miR-21的靶标（图 S2）。¹³ 我们接下来检查了SC诱导的miR-21下调和抑制肿瘤细胞进展的机制。MAPK 激酶，包括 p38、JNK 和ERK，可以响应癌症中的多种刺激而被激活；¹⁷ 因此，我们询问MAPK信号通路是否参与了SC诱导的肿瘤进展的介导。

如图图4A和4B所示，SC处理激活了p38MAPK的磷酸化，但不激活ERK或 JNK，表明p38MAPK通路可能参与了SC的功能。为了进一步探讨p38MAPK通路介导S诱导的细胞活力、迁移和侵袭过程的作用，在细胞中同时加入p38MAPK特异性抑制剂SB203850与SC，然后对细胞活力（图 4C)、入侵(图 4D), 和迁移 (图 4E) 进行了测定。当SB203850处理与SC组合时，SC处理对细胞的抑制作用部分恢复。此外，SB203850阻断p38MAPK信号通路后，SC诱导的 miR21 表达水平下降也得到缓解（图 4F）。

总之，这些数据表明 SC 可以通过 p38MAPK 信号通路抑制癌细胞的活力、侵袭和迁移。

SC通过调节miR-21表达抑制上皮间充质转化

最近的研究表明，miR-21可以促进多种恶性肿瘤的EMT，包括胆管癌和乳腺癌。^18–20 因此，我们试图弄清楚SC是否通过调节HNSCC中的miR-21表达对其EMT表型产生影响。为此，在UM-SCC22B和UM-SCC-47细胞中检测了EMT标志物的蛋白质和mRNA表达水平。如图5A-5D所示，SC在蛋白和mRNA水平都明显降低间充质标志物波形蛋白的表达并增加上皮标志物E-钙粘蛋白的表达，蛋白质印迹实验结果如图5A和5B所示和实时定量 PCR结果如图5C和5D。相反，通过用 miR-21 模拟物转染过表达miR-21同SC联用则逆转了波形蛋白和E-钙粘蛋白标记物的蛋白质和mRNA表达。与这些结果一致，仅用 SC 或用 miR-21 治疗在随后的免疫荧光测定中也观察到波形蛋白和 E

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