DNA片段通过多层石墨烯纳米孔迁移动力学的理论研究

作者：Lijun Liang,^ab Zhisen Zhang,^a Jiawei Shen,^c Kong Zhe,^d

Qi Wang,^*a Tao Wu,^a Hans Agren^b and Yaoquan Tu^*b

单位：^a浙江大学软物质研究中心化学系，杭州 310027，^b英国皇家理工学院生物技术学院理论化学与生物系，瑞典斯德哥尔摩 SE-10691，^c杭州师范大学医学院，杭州 310016，^d杭州电子科技大学材料与环境工程学院，浙江杭州 310018

摘要：固体纳米孔，特别是石墨烯纳米孔，由于与普通测序技术相比具有几个潜在的优点，最近作为 DNA 测序的生物传感器材料得到了广泛的探索。针对单碱基分辨率的单层石墨烯纳米孔的研究最近已经扩展到多层石墨烯 (MLG) 薄膜，表明 MLG 纳米孔在 DNA 测序方面优于单层石墨烯纳米孔。然而，DNA 易位到 MLG 纳米孔的潜在动力学和电流变化仍然知之甚少。本文报道了 DNA 通过不同层次石墨烯纳米孔的分子动力学研究。结果表明，在强电场作用下，增加石墨烯的层数(7层)可以延长 DNA 的移位时间，并且 DNA 通过 MLG 纳米孔后，DNA 移位的电流会发生逐步变化。建立了电流变化与 MLG 纳米孔未占用体积之间的关系模型。我们证明 DNA 移位的动力学特别依赖于核苷酸与石墨烯的相互作用。因此，我们的研究表明，在一定范围内增加石墨烯层数，并对石墨烯纳米孔进行表面修饰，可以提高 DNA 检测的分辨率。

关键词：DNA 片段；多层石墨烯；理论研究

1.引言

在存在外部偏置电压的情况下，分散在盐溶液中的 DNA 或 RNA 分子可以被驱动通过纳米孔，从而中断盐离子的流动，并触发可检测的离子电流变化，这可用于探测分子中碱基的同一性^[1,2]。利用纳米孔（如固态^[3-8]或生物纳米孔^[9-11]）进行DNA测序被认为优于其他测序技术，近年来发展异常迅速。例如，通过使用突变的 MspA 纳米孔和 phi29 DNA 聚合酶，Manrao 等人能够以单核苷酸分辨率读取 DNA^[12]。

使用生物纳米孔的一个优点是，它们可以通过先进的分子生物学技术进行化学工程。然而，脂质膜对生物纳米孔的温度、pH 值和盐浓度敏感，使得生物纳米孔的稳定性难以控制。相比之下，利用已有的技术，可以用氮化硅^[13-15]、氧化硅^[16,17]或金属氧化物制备非常稳定且功能上有用的固态纳米孔^[18]。由于所用纳米孔的坚固性和调整大小和形状的能力，不同类型的纳米孔已被用于 DNA 测序^[5]。然而，固态纳米孔的厚度通常为数十纳米，这使得低噪声检测很难对 DNA 进行测序^[19]。

近年来，由石墨烯薄片制备的固态纳米孔由于石墨烯的独特性质而引起了人们的极大兴趣^[21-24]。然而，用单层石墨烯纳米孔以单核苷酸分辨率读取 DNA 分子受到 DNA 快速易位速度的阻碍^[25]。为了解决这一问题，人们进行了许多理论和实验研究，如研究降低温度、降低施加电压或增加溶剂粘度等^[26-29]。然而，这些方法无法改变 DNA 通过纳米孔的易位动力学。最近，在这方面已经制备和测试了少于10层的多层石墨烯（MLG）薄膜，发现其性能优于单层石墨烯薄膜^[30]。Kim^[31]等人指出，与单层石墨烯相比，多层石墨烯具有低噪声比。尽管 MLG 纳米孔的 DNA 测序已经被深入研究^[32]，但测序过程的动力学和细节仍然不清楚。

我们的工作目的是应用分子动力学（MD）模拟研究 DNA 分子通过纳米孔易位的原子细节。MD 模拟已经成功地应用于电场驱动的DNA易位的研究^[33-36]。在这项工作中，我们进行了 MD 模拟来研究 DNA 通过 MLG 纳米孔的易位。由于其简单性，poly(A-T)₄₅ 被用作模型DNA片段。我们证明了将石墨烯层增加到一定范围可以延长易位时间。通过研究DNA 片段通过 MLG 纳米孔的电流变化，我们建立了一个模型，探讨了纳米孔未占用体积与信号电流的关系，并研究了核苷酸易位速度与核苷酸与石墨烯片相互作用的关系。

2.计算方法

2.1系统设置

表 1列出了在这项工作中研究的系统。对于每个系统，一个 MLG 片放置在 x - y 平面上，其质量中心位于笛卡儿坐标系的原点(0,0,0)。通过删除坐标为 x² y² lt; d² 的原子构建了一个纳米孔，其中D为石墨烯纳米孔的半径，设定为 1.5 nm，多层石墨烯片中的键长为 1.42 Aring; ，并分离石墨烯片之间的距离是 3.4 Aring; 。通过使用 Hyperchem 软件(版本7.0， Hypercube，Inc )构建 poly(A-T)₄₅ 将纳米孔和 poly(A-T)₄₅ 放在一个盒子里，用 45340 TIP3P 水分子溶剂化^[37]。 TIP3P 水模型与本研究用来模拟 DNA 片段的 CHARMM 力场是相容的。然后系统经历了10000步的能量最小化。此后，通过随机替换水分子，添加 KCl 使其浓度等于实验^[38]中的1.0 M。然后，该系统受到20万步能量的影响最小化。在所有的模拟中，模拟盒的长度在 x 和 y 方向上均为 90 Aring; ，而在 z 方向上，模拟盒的长度随梯度层数的增加而变化，在不同石墨烯层的不同模拟中，模拟盒的长度在 z 方向上从250 Aring; 到270 Aring; 不等。图 1显示了 poly(A-T)₄₅ 和三层石墨烯纳米孔的系统的初始设置。

所有 MD 模拟均由 Gromacs 程序^[39]执行三次，时间步长为 2.0 fs ，所有涉及 H 原子的键均固定。所有模拟中的密度从1.051到1.054 g cm^-3不等。 DNA 片段和 KCl 由 Charmm27 力场模拟^[40]。石墨烯片中的所有碳原子都被设置为中性。石墨烯碳原子的 Lennard-Jones 参数为^[36,41]

周期性边界条件在各个方向都被使用。非键合范德华相互作用的截止由从1.0 nm 开始并在1.2 nm 处达到零的开关函数来设置。采用朗之万法将模拟温度保持在298.0 K ，并将各个方向的压力设置为101.3 kPa 。采用粒子网格 Ewald 求和方法恢复长程静电相互作用，直接空间求和和倒易空间求和的截止值为1.3 nm 。

在所有模拟中，施加100 mV nm^-1 的偏压驱动离子和DNA片段通过纳米孔。该偏置电压的大小与我们之前工作中使用的相同^[36]。

表 1系统研究^a

^a在所有的模拟中，KCl的浓度都是1.0 M 。

图 1具有 poly(A-T)₄₅ 和三层石墨烯纳米孔的系统初始设置。 DNA 片段被放置在石墨烯纳米孔的顶部，如 VDW ( Van Der Waals )模型所示。 K (粉红色)和 Cl^- (绿色)符合 CPK ( Corey-Pauling-Kortum )模型。为了清晰起见，未显示水分子。

2.2分析方法

为了描述 DNA 分子通过纳米孔的阻断电流并解释这一现象，时间相关的离子电流 I(t) 计算如下^[26]：

其中 L_z 是系统在 z 方向上的长度，z_i(t) 是原子 i 在时间 t 的 z 坐标，Delta;t设置为10.0 ps，N 是原子总数，包括 DNA 和离子的原子数，q_i 分别是原子 i 的电荷。核苷酸与每个石墨烯层的相互作用通过以下公式计算：

其中 E_int 是核苷酸与石墨烯层的相互作用，E_gra、E_nuc、E_{gra nuc} 分别是石墨烯层、核苷酸和石墨烯与核苷酸的势能。

3.结果和讨论

3.1开放纳米孔电阻

在我们之前的工作中，我们研究了纳米孔直径与其开放纳米孔电阻之间的关系^[42]。在这里，评估了纳米孔的电阻（Res），纳米孔的直径设置为3 nm。在实验中使用的相同 KCl 浓度（1.0 M）下，对石墨烯层数从1到9的石墨烯进行了一系列MD模拟^[38]。由于外加电场，K 和Cl^-被驱动向相反的方向移动，平均离子电流lt;Igt;由方程（1）计算得出。V/lt;Igt;曲线的斜率被确定为纳米孔的电阻。根据实验数据^[25]，直径为3 nm的单层石墨烯纳米孔的电阻应为273.02 MOmega;，在我们的模拟中为38.2 MOmega;。这表明我们模拟的孔隙阻力低于实验结果。一个原因是，我们使用的电压比实验中使用的电压大，因为与实验中使用的电压类似的低电压可能需要很长的模拟时间，这与我们的计算资源不符^[26]。另一个问题是，模拟中没有考虑石墨烯纳米孔的电荷分布，并且需要改进描述离子与石墨烯相互作用的力场。我们注意到，石墨烯片的厚度与石墨烯层的数量成正比，定义为L。如图 2所示，石墨烯纳米孔的电阻与石墨烯层的数量密切相关，石墨烯层的数量可以表示为 Res-L。这反映了石墨烯片的开放纳米孔电阻也与其厚度成正比，并且检测电流随着石墨烯层的增加而相应减小。Lv 等人还讨论了电流与石墨烯纳米孔层之间的关系^[32]。他们证明了离子电流对石墨烯层数敏感，这与我们在这项工作中的结果一致。由于很难通过实验控制石墨烯片的厚度，石墨烯片的电阻对其厚度的依赖性尚不清楚。在这里，我们定性地探讨了开放纳米孔电阻与厚度之间的关系。K 和Cl^- 在外加电场下的运动有助于测量电流。对于Sim2，K 和 Cl^- 发现电流中的离子几乎相同(见图 3A)。为了更深入地解释这一现象，计算了 K 和 Cl^- 在笛卡儿坐标系的 z 方向，即外加电场方向上的均方位移（MSDs）。如图 3B所示，两个离子在相同的模拟时间内的 MSDs 几乎相同。

图 2开放纳米孔电阻随石墨烯层数的变化

图 3 (A) K 和 Cl^- 对sim2电流的贡献 (B) sim2中 K 和 Cl^- 的 MSDs

3.2石墨烯层数的影响

图 4显示了 DNA 片段通过1、3、5、7和9层石墨烯纳米孔时电流的变化。如图所示，易位时间约为0.6 plusmn; 0.2、1.9 plusmn; 0.8、3.6 plusmn; 0.9和5.1 plusmn; 1.2 ns 分别为1、3、5和7层的纳米孔，我们模拟的 45bp 的位移时间比实验快得多^[25]。另一个原因是这里使用的力场不能描述石墨烯纳米孔的电荷分布，需要改进。与单层石墨烯片相比，易位时间明显延长。这意味着增加石墨烯层的数量可以增加易位时间。应用石墨烯纳米孔探测 DNA 分子的主要挑战之一是降低 DNA 分子的速度^[43]。因此，我们的结果表明，使用 MLG 纳米孔可以大大延长 DNA 片段的易位时间。然而，如果石墨烯层的数量增加，例如超过10层（参考文献30和44），石墨烯纳米孔的电子结构接近石墨的三维极限^[45]，并且可以影响石墨烯纳米孔的电性质，并在 DNA 测序中产生高噪声。因此，石墨烯层的数量应小于10。正如我们从图 4中看到的，如果石墨烯层数在1、3、5和7之间变化，那么移位时间几乎与石墨烯层数成正比，而通过9层纳米孔的移位时间变得非常短。正如其他人所报道的那样，碳纳米管越长，管中的势阱越深，因此蛋白质可以自发地被包裹进一个更长的碳纳米管^[46,47]。纳米孔也是如此：随着纳米孔厚度

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