索氏提取法和超临界CO2萃取法提取卡拉里亚松松果中黄酮类化合物的比较研究外文翻译资料

索氏提取法和超临界CO₂萃取法提取卡拉里亚松松果中黄酮类化合物的比较研究

Levent Nuralın¹ Metin Guuml;ruuml; ¹ Servet Ccedil;ete² Institute of Chemistry, Slovak Academy of Sciences

摘要：本研究采用超临界CO₂（Sc-CO₂）萃取法和索氏提取法提取卡拉里亚松的松果油。采用高效液相色谱法对油中槲皮素、芦丁和山奈酚（QRK）的含量进行了测定。其中芦丁有可能成为抗新冠病毒的潜在药物。通过扫描电镜（SEM）和比表面积分析仪(BET)分析观察Sc-CO2萃取后的结构变化和表面积增加。对影响提取率的因素进行研究：温度为35–65°C，压力为140–220 bar，平均粒径为0.30–1.00 mm，二氧化碳流速为3–7 L/min，共溶剂添加量为0–8%w/w，萃取时间：30–150 min。比较Sc-CO₂萃取法与索氏提取法的提取结果，发现不添加共溶剂总QRK的最大提取率为4.18%，而在添加共溶剂的Sc-CO₂萃取法所得总QRK的最大提取率为30.94%。Sc-CO₂萃取法所得Q、R和K的提取率分别为14.75plusmn;1.08micro;g/g、14.23plusmn;1.27micro;g/g和15.70plusmn;1.13micro;g/g。索氏提取法所得Q、R和K的提取率分别为36.43plusmn;2.26mu;g/g、57.19plusmn;3.81mu;g/g和50.80plusmn;2.79mu;g/g。通过添加8%乙醇（按质量计），Sc-CO₂萃取法测得QRK的最大提取率为44.68plusmn;2.89mu;g/g，索氏法测得QRK的最大含量为144.42plusmn;5.39mu;g/g。提Sc-CO₂萃取法的提取率是索氏提取法的30.94%。

图文摘要：

关键词：卡拉里亚松；抗氧化剂；芦丁；槲皮素；超临界萃取；索氏提取

符号列表

Sc-CO₂ 超临界二氧化碳

SFE 超临界流体萃取

SD 标准差

p 显著区间

HPLC 高效液相色谱

R2 相关系数的平方

tau; 时间常数 （Tau）

RMSE 均方根误差

1.引言

在过去，林业废弃物可以用作薪材或装饰物，但如今，由于其生物活性含量的高潜力，它们作为获取生物活性化合物的来源受到了广泛关注。松科松树属中大约有200种松树被认为是针叶树。这些松树的特征规格在尺度和形状上几乎相等（Turley等人，2006年）。卡拉里亚松属于这个科，是东地中海地区的一个广泛物种。卡拉里亚松是一种针叶树和常绿树，生长到7-20米高。松树的这种潜力使之被认为是一种容易获得的资源，可以被很容易地收集和利用，用于生产生物活性化合物。卡拉里亚松含有丰富的萜类、黄酮类、木脂素、多酚类和油性成分。卡拉里亚松的松果也含有有价值和治疗作用的植物化学化合物。由于世界范围内不断增加的回收利用趋势，这种资源可以用作生产有价值的提取物和生物活性物质的原料。

在文献中，四种松树的幼叶针叶中含有酚类化合物和类黄酮（Karapandzova等人，2015）。通过固相微萃取分析，包括卡拉里亚松在内的六种针叶树种中有许多成分被确定为VOC含量（Ozgenc等人，2017a）。对卡拉里亚松和松果松的水蒸馏提取物进行了体外抗氧化、植物毒性、杀虫和抗菌活性研究（Ulukanli等人，2014年）。此外，还研究了湿地松针叶的抗氧化成分，以确定微波辅助提取的最佳条件（欧阳等人，2017年）。在另一项研究中，卡拉里亚松表现出很高的抗真菌活性（Ozgenc等人，2017b）。在其他四种松中，卡拉里亚松甲醇提取物中的总酚含量最高（Yener等人，2014年）。这种类型的松树可以治疗肌痛、风湿痛、呼吸问题、支气管炎、支气管哮喘、咳嗽、鼻窦炎、喉炎、气管炎、咽炎、肺气肿和流感（Vuorela et al.2005）。黄酮类化合物对人体健康有许多保护和预防作用。芹菜素、木犀草素、紫杉醇、槲皮素、山奈酚和染料木素被证明能抑制卵巢癌细胞的生长，并强烈抑制人类卵巢癌细胞的细胞增殖（Luo等人，2008年）。据报道，芦丁（维生素P）是一种化合物，通过内质网应激信号通路抑制卵巢癌细胞的活力并诱导细胞凋亡（Zhao等人，2017年）。目前的一项电子研究表明，芦丁可以通过抑制新冠病毒19表面的主要蛋白酶更成功地用于新冠病毒19的治疗（Al Zahrani 2020）。槲皮素已被确定为最活跃的类黄酮。此外，这种类黄酮增加了其他类黄酮的活性，并对胃癌细胞具有抗转移作用（Li和Chen，2018）。含山奈酚的饮食具有有益的效果，尤其是对于降低慢性病的风险。此外，它还通过抗氧化性增强身体的防御能力，对抗导致癌症发展的自由基（Chen和Chen 2013）。该化合物对抑制癌细胞非常有效，并能改变不同的细胞信号通路，与普通化疗药物相比，山奈酚对健康细胞的毒性要小得多（Ramos 2007），（Zhang等人，2008）。在另一项研究中，通过氧化石墨烯辅助乙醇回流提取法研究了银杏叶中槲皮素、芦丁、山奈酚和异鼠李素的化合物（Gong等人，2020年）（图1）。

随着人们对生物活性化合物的需求不断增加，从松树的松果中提取一些有价值的黄酮类化合物被认为是一个重要的商业研究领域。

除了我们的研究之外，本研究所还对同一科的树木进行了一些研究。通过乙醇改性的超临界流体萃取（SFE）从卡拉里亚松（松树皮）中提取的士福林的最佳条件的确定（Ghoreishi等人，2016a），以及从黄松（黄松）中获得油和脂肪酸的最佳Sc-CO₂萃取条件的确定（Ritter和Campbell 1991），文献中还提供了桦树皮（Krasutsky 2006）研究中的苏木酸、三萜和其他有益成分。同样，通过SFE法对从松树皮中提取更高抗氧化剂的提取条件进行了优化研究（Braga等人，2008年）。通过Sc-CO₂萃取法研究了土耳其和德国不同松树的黄酮含量和抗氧化能力（Yesil Celiktas等人，2009年）。SFE方法是一种有利且环保的技术，适用于制药、食品和化妆品等高附加值行业。在煤炭和生物质合成天然气生产设施中，可以大量、高纯度地生产环保Sc-CO₂萃取所需的CO₂（Bassano等人，2020年）。

图1代表槲皮素、芦丁和山奈酚。原子用传统的颜色编码表示：氢（白色）、碳（黑色）、氧（红色）（原始含量）

2.实验

材料、参考标准

在这项研究中，从土耳其安卡拉的戈尔巴什地区采集新鲜和成熟的卡拉里亚松松果作为原料。松果被实验室的破碎机粉碎，然后，粉碎的样品在阴影中干燥。干燥后，用Retsch（德国哈恩）牌植物研磨机和Bosch（南非米德兰）牌咖啡研磨机将样品研磨成小颗粒。然后，将松果样品分为五种不同的尺寸，平均为0.30毫米、0.55毫米、0.65毫米，

0.85毫米和1.00毫米。标准槲皮素(ge; 95%）和芦丁三水合物(ge; 95%，称为芦丁），来自西格玛（德国达姆施塔特）和山奈酚(ge; 来自开曼群岛（美国密歇根州）的95%用作底漆校准标准。HPLC柱为C-18 RP-Sigma（德国达姆施塔特）柱。

化学制品

乙腈（纯度）ge; 99.9%），甲醇（纯度ge; 99.9%）和乙醇（纯度ge; 99.9%用作流动相和溶剂。它们是从默克公司（德国格恩希姆）购买的。甲酸（纯度）ge; 99.9%也由默克（德国格恩希姆）提供，作为流动相的缓冲。这些化学品用于索氏提取、Sc-CO₂提取和HPLC分析。虹吸液体二氧化碳（99.99%）由土耳其安卡拉Oksan天然气公司供应。去离子水采用SG牌反渗透净水器系统生产。

高效液相色谱分析

用HPLC系统分离所有提取物中的单独目标类黄酮化合物。该系统为Dionex 680 HPLC（美国加利福尼亚州），带有UVD 170U检测器、P680四元泵和Sigma C-18 RP型柱（内径100times;3.0 mm，dp=2.7mu;m）。流动相溶液的配方如下：去离子水/甲酸的比例为99.9:0.1，v/v（A），乙腈/甲醇的比例为75:25，v/v（B）。

以0.5 ml/min的恒定流速进行洗脱梯度程序，如下所示：B中80–20%的a的0–5 min，B中60–40%的a的5–10 min，B中10–15 min 30–70%的a，B中15–20 min 80–20%的a。手动注射回路尺寸为20mu;l。UVD 170U检测器的检测波长为256 nm。该波长适用于所有槲皮素、芦丁和山奈酚的紫外吸收。QRK储备标准溶液在乙醇中制备为100 ppm，并稀释至2,10,50 ppm，作为三点校准标准。

索氏提取法

对于每次索氏提取，称量10 g平均粒径为0.3 mm的粉末状粗松松果样品，并将其放入索氏设备中，并使用170 ml乙醇作为有机溶剂连续提取7 h。文献中使用了类似的索氏应用条件和回收率计算（Ghoreishi等人，2016b）。HPLC分析用于测定乙醇提取物中QRK的含量和回收率。

超临界CO₂萃取法

在整个研究过程中，应用分离品牌实验室规模的SFE设备的Spe-ed SFE模型用于提取卡拉里亚松松果样品。该设备的系统包括一台空气压缩机、一台空气驱动的液态CO₂泵、一台用于冷却加压泵的再循环和冷却槽、一台提取器、一台用于共溶剂泵送的高压液体泵、一台温控烘箱、一台萃取收集容器、一台加热的二氧化碳出口装置、，针阀用于安排CO₂的输出流量，流量计用于监测CO₂的输出流量。在所有Sc-CO₂萃取过程中，使用了一个24毫升的内容萃取器。在提取器中装入5g卡拉里亚松松果样品，并将玻璃棉置于提取器中样品的上方和下方。

所有提取研究均在30-150分钟的收集时间、140-220巴的压力范围、35-65°C的温度范围、3-7升/分钟的氧气流量范围和0.30-1.00毫米的平均粒径范围内进行。提取的样品保存在大约minus; 6°C，保存所有化学成分，直到HPLC分析。根据CO₂质量流量确定了共溶剂流量，并考察了乙醇质量比2.0%、3.5%、5.0%、6.5%和8.0%对萃取效率的影响。

扫描电子显微镜（SEM）分析

在超临界CO₂萃取过程前后分离的卡拉里亚松松果样品的地形表面图像，用Au–Pd覆盖三次180秒以导电，并使用Jeol品牌JSM-6360 LV型SEM设备对样品进行分析。

Brunauer–Emmett–Teller（BET）表面积分析

对超临界CO₂萃取前后分离的卡拉里亚松松果样品的表面积进行了分析，以观察萃取效率。这些样品分别称重为0.0997 g和0.0923 g，并在90°C下使用Quantachrome Nova 220型BET装置进行脱气处理5 h后进行分析。

结果与讨论

超临界CO₂萃取法是一种从植物中快速有效地提取生物活性化合物的方法。根据文献确定了实验工作范围。Sc-CO₂从卡拉里亚松树皮中提取杉叶素的最佳温度和动态提取时间分别为43°C和138 min（Ghoreishi et al.2016a）。胡颓子种子中槲皮素的最佳CO₂流量和Sc-CO₂提取时间分别为5 l/min CO₂和120 min（Nuralin等人，2017年）。选择了压力、温度、平均粒径、CO₂流量、共溶剂比、萃取周期等工艺参数对卡拉里亚松-松果Sc-CO₂萃取进行了研究。根据这些研究，并考虑Sc-CO₂萃取装置的安全工作范围，确定了工作条件。选择的范围为140-220bar、35-65摄氏度、0.30-1.00毫米、3-7升/分钟二氧化碳、0-8%共溶剂、30-150分钟萃取时间。提取和制备样品后，通过HPLC分析的面积数据计算槲皮素、芦丁和山奈酚校准曲线的r2值，分别为r2:0.9973、r2:0.9904和r2:0.9909。通过比较引物标准品和样品的特征色谱保留时间，对每个目标类黄酮进行鉴定和定量，并逐个计算定量。每个分析重复两次。Sc-CO₂萃取法的QRK恢复值通过公式1计算：

mu;g QRK(by SCCO₂)

g Raw material

QRK值恢复= mu;g of extractableQRK (by Soxhlet)

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