由Mps1 MAP激酶调控的糖原合酶激酶MoGsk1在稻瘟病菌发育和致病中的调控机制研究外文翻译资料

由Mps1 MAP激酶调控的糖原合酶激酶MoGsk1在稻瘟病菌发育和致病中的调控机制研究

作者：

Tengsheng Zhou^1,2, Yasin F. Dagdas³, Xiaohan Zhu^1,2, Shiqin Zheng¹, Liqiong Chen², Zachary Cartwright³, Nicholas J. Talbot ³ amp; Zonghua Wang^1,2

单位：Fujian University Key Laboratory for Functional Genomics of Plant Fungal Pathogens, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, 350002, China

摘要：

稻瘟病的致病因子稻瘟病菌是最具破坏性的植物病原体之一，对水稻和小麦等主要作物造成重大产量损失。这种真菌用一种被称为附着胞的特殊细胞感染植物，这种细胞的发育受到MAPK信号通路的严格调控，随着上游传感器对环境刺激的响应而激活。在这里，我们发现M.o yzae中糖原合酶激酶3 (GSK3) MoGSK1的表达受Mps1 MAP激酶的调控，特别是在胁迫条件下。因此，本研究对MoGSK1进行了功能表征。MoGsk1是酿酒酵母GSK3同源物MCK1的功能同源物。MoGSK1基因的替换导致菌丝生长明显延迟，分生孢子完全丧失，菌丝形成的附着胞状结构无法穿透宿主表面，从而导致致病性丧失。然而，Delta;mogsk1的发育和致病缺陷是通过小麦赤霉病菌GSK3同源基因FGK3的异源表达而恢复的，FGK3编码的产物也显示出与MoGsk1在M.o ryzae中的胞质定位相似。相比之下，过表达MoGSK1在M.o ryzae中产生了变形的附着胞。综上所述，我们的研究结果表明MoGsk1作为一个高度保守的信号调节因子，调控了M.o ryzae的生长、分生孢子和致病性。

植物病原真菌对全球粮食安全构成持续的威胁^[1]。稻瘟病菌Magnaporthe oryzae (pyrariaria oryzae)是对水稻最具破坏性的植物病原体，每年造成的水稻产量损失高达30%^[2]。除了大米，它还会导致其他谷物的产量损失，如小麦、大麦和小米^[3-5]。当三细胞分生孢子落在叶表面时，真菌的侵染周期开始。孢子落在角质层上，形成极化芽管。对环境线索的识别，如表面疏水性和韧性，导致芽管顶端肿胀，然后分化成被称为附着胞的特殊感染细胞。附着胞在黑化细胞壁的帮助下积累甘油，产生巨大的膨压。它的压力转化为机械力穿透植物表面，随后进一步侵入菌丝扩张，在植物组织中定植^[6]。

叶表面线索的感知是介导附着胞发育的细胞反应启动的关键。这些形态发生事件的协调受保守的MAP激酶通路控制^[7]。在M. oryzae中，MAPK通路有三种，分别是Pmk1、Hog1和Mps1。Pmk1是附着胞发育的中央调控因子，突变的Pmk1不能形成附着胞并引起疾病^[8]。Hog1对于真菌的毒力是不可缺少的，但对于适应渗透胁迫是必要的^[9]。与Pmk1在附着胞形成中的重要作用相反，Mps1通过调节作用在植物表面渗透附着胞中发挥重要作用。

¹福建农林大学福建省大学植物真菌病原功能基因组学重点实验室，²福州350002埃克塞特大学生物科学学院，³英国埃克塞特EX4 4QD周腾生和亚辛达达斯对这一工作作出了同样的贡献。有关材料的函件和要求应寄给N.J.T.(电子邮件:n.j.talbot@exeter.ac.uk)或z.w(电子邮件:wangzh@fafu.edu.cn)真菌细胞壁完整性^[10]。Mps1除了在发病机制中发挥作用外，还在M. oryzae的分生孢子和细胞应激反应中发挥作用^[10]。Mps1通路下游因子的识别对于理解真菌发病机制所需的信号网络至关重要。到目前为止，Mps1途径的两个效应物已被鉴定在M. oryzae中，Mig1是一种MADS-box转录因子，在酵母双杂交实验中已被证明与Mps1直接相互作用。^[11]在M. oryzae中，mig1突变体能够形成附着胞，渗透到植物表面并细化成初级感染性菌丝，但不能扩展到邻近细胞，导致致病性丧失。M. oryzae Swi6是一个APSES家族转录因子，在体内和体外实验中也与Mps1发生物理相互作用。Delta;swi6突变体形成变形和非黑化附着胞，由于细胞壁完整性受损，附着胞无法穿透植物表面^[12]。

除了靶向细胞核中的转录因子外，酿酒酵母Mpk1的同源物Mps1已被证明在细胞质中发挥作用，介导对环境应激的信号级联反应^[13]。糖原合成酶激酶3 (GSK3)是一种独特的激酶，它具有保守的蛋白结构和磷酸化特性，但在真核生物中介导多种信号通路中发挥不同的作用^[14]。GSK3最初被认为是一种磷酸化糖原合酶并使其在兔细胞中受到抑制的激酶^[15]。越来越多的文献表明，GSK3能够磷酸化各种靶蛋白，以调节多种细胞事件，并受其他激酶磷酸化，以响应不同的信号^[16]。例如，MAPK级联作用使GSK3 n端丝氨酸残基发生磷酸化，并使其在胰岛素样生长因子作用下受到抑制^[17]，进而导致GSK3下游靶向蛋白的去磷酸化和激活^[16]。事实上，作为一种无处不在的激酶，抑制GSK3释放下游靶向蛋白的活性，支持其调控功能。GSK3的主要作用之一是调节细胞对细胞外刺激的反应。在酿酒酵母中，鉴定出4个与哺乳动物GSK3同源的基因，包括MCK1，该基因负责在不同环境胁迫下激活应激反应转录激活因子MSN2^[18]。MCK1也是细胞周期进展的关键调控因子，促进CDC6p作为前复制复合体(pre-RC)^[19]的重要组成部分的定时降解。在植物病原镰刀菌(Fusarium graminearum)中，鉴定出一个GSK3的同源基因Fgk3，并证明Fgk3是正常生长、分生、有性生产和致病所必需的^[20]。Delta;fgk3突变体的多重表型效应表明，Fgk3是一种保守的调节因子，参与真菌发育的各个方面。这项研究还表明，Fgk3与MSN2在物理上相互作用，并控制低温、高温和盐胁迫下应激反应相关基因的表达。

在对M. oyzae中Mps1 MAP激酶通路下游可能靶点的初步筛选中，我们发现在Mps1缺失和环境胁迫下，疏水蛋白基因MPG1和糖原合酶激酶3(GSK3)的同源物MoGSK1存在差异表达。在此，我们研究了M. oryzae 中GSK3同源物(MoGsk1)在MPS1 MAPK通路转录调控下的功能，揭示了其在真菌发育和植物感染中的关键作用。缺失mogsk1会显著降低菌丝生长，并导致正常传播和感染所必需的无性孢子产生的损失。此外，使用Delta;mogsk1的菌丝栓接种表明，该突变体未能穿透附着胞样结构，无法感染大麦或水稻寄主植物。互补小麦镰刀菌(Fusarium gramienearum)的同源基因FGK3完全恢复了Delta;mogsk1的生长和致病性，其基因产物表现出与MoGsk1相同的胞质定位。Tis表明在稻瘟病菌和禾谷霉具有高度保守的功能。MoGSK1的过表达导致附着区变形，这可能是由于形态发生检查点的失调。综上所述，我们的研究结果证明MoGsk1是一个参与应激反应机制的中央信号调节因子，控制M. oryzae从生长、无性繁殖到发病的多个发育方面。

结果

MPG1和MoGsk1作为Mps1 MAP激酶通路靶点的鉴定。 为了根据Mps1 (MGG_04943.6)突变体和野生型M. oryzae Guy11的表达分化来确定Mps1 MAP激酶通路的下游调控靶点，Northern blot分析结果显示，在不同胁迫条件下，稻株MGG_10315.6和MoGSK1的唯一同源基因MGG_12122在不同胁迫条件下表现出不同的表达模式。在Delta;mps1突变体中，与Guy11相比，MPG1在完全培养基(CM)、急、慢性盐胁迫和无硝酸盐盐的最小培养基(MM)条件下表达下调(图1A)(第1-4道)。然而，在低渗透胁迫(水)下，MPG1的表达上调(图1A)(第6道)。在MM无碳源的培养基中，MPG1的表达没有变化(图1A)(第5道)。与Guy11相比，在CM培养基中Delta;mps1突变体mogsk1的表达上调。与Guy11相比，在Delta;mps1突变体中，当菌丝暴露于急性和慢性盐胁迫时，MoGSK1的转录诱导似乎更加显著(图1B)。有趣的是，在所有的体外测试条件下，在Guy11中几乎都检测不到MoGSK1的转录(图1B)，这表明在野生型菌株的菌丝阶段，Mps1对MoGSK1的转录具有抑制作用。疏水蛋白Mpg1在M. oryzae感染相关发育中的重要性已经被很好地描述了^[21,22]，这里我们决定重点研究MoGSK1的功能表征。

为了确定MoGsk1与GSK3中其他真菌成员的系统发育关系，我们对酿酒酵母(S. cerevisiae)、小麦炭疽病菌(F. graminearum)、小麦炭疽病菌(Colletotrichum graminicola)和玉米黑粉病(Ustilago maydis)中已鉴定和预测的GSK3成员进行了蛋白比对。MoGsk1与cerevisiae Mck1的同源性为41%，与F. graminearum Fgk3的同源性为91%，与预测的C. graminicola CgGsk1的同源性为92%，与预测的黑穗病菌UmGsk1的同源性为69%(图S1)。先前的研究表明，酿酒酵母MCK1的破坏会导致冷敏感性的增加^[23]。为了检测MoGsk1是否是一个功能性的GSK3同源物，我们在酵母Delta;mck1突变体中，在酿酒酵母半乳糖诱导的GAL1启动子下表达了MoGSK1。

在图1下。与Guy11相比，Delta;mps1突变体中MPG1和GSK1的表达存在差异。(A) Guy11和Delta;mps1中MPG1在不同生长条件下的RNA凝胶印迹分析:厘米中(巷1)厘米 0.4 m氯化钠(急性治疗)(巷2)厘米 0.4 m氯化钠(慢性治疗)(巷3),MM硝酸介质minus;盐(巷4),MMminus;葡萄糖(巷5),和无菌蒸馏水(巷6)。(B) RNA凝胶MoGSK1的污点分析Guy11(巷1)和Delta;mps1(巷2)厘米,生长情况的条件CM 0.4M NaCl(急性处理)和CM 0.4M NaCl(慢性处理)。从CM培养48h的菌丝中提取总RNA，然后转移到上述不同的液体培养基中再生长24h。在慢性NaCl处理中，菌丝在CM 0.4M NaCl中生长48h后，转移到新鲜0.4M NaCl培养基中再生长24h。

图2。M. oryzae MoGSK1可以在功能上补充酿酒酵母Delta;mck1突变体。酵母菌株在添加半乳糖或葡萄糖的YP培养基上，在12℃条件下生长14天。检测前用含有1times;10⁶、5times;10⁵、1times;10⁵、5times;10⁴或1times;10⁴细胞/ml的10mu;l液滴接种培养皿，培养14天。三角形表示酵母细胞浓度下降。BY1471 (WT)是酿酒酵母野生型菌株。Delta;mck1是对寒冷环境敏感的酵母突变体。Delta;mck1:MoGSK1转化子在酵母半乳糖诱导的GAL1启动子下表达M.o ryzae MoGSK1。阴性对照是用空pYES载体转化的Delta;mck1突变体。以半乳糖为碳源诱导后，MoGsk1恢复了Delta;mck1突变体在12℃条件下生长14天的耐寒性(图2)。

MoGsk1对正常菌丝生长和分生孢子至关重要。 为了功能表征MoGsk1，我们在野生型M.o yzae Ku80菌株中对MoGsk1进行了靶向基因替换(图S2)。Delta;mogsk1突变体在CM培养基上表现出显著的生长下降(图3A)。事实上，与Ku80相比，Delta;mogsk1的增长率显著下降。Delta;mogsk1在燕麦培养基上持续光照培养时未检测到孢子(图3B)。用乳酚苯胺蓝检测耐染色的真菌分生孢子。对真菌气生结构的染色显示，Delta;mogsk1中只有气生菌丝，没有分生孢子梗，而Ku80的分生孢子梗保持灰色(图3C)。然而，当MoGSK1基因在Delta;mogsk1中在本地启动子下表达时，互补菌株Delta;mogsk1/MoGSK1在菌丝生长和分生过程中的缺陷完全恢复。结果表明，MoGsk1在真菌的生长和分生过程中发挥着关键作用，与酿酒酵母和禾谷酵母的GSK3同源物相似^[20,24]。

图3。Delta;mogsk1突变体的菌落形态和分生孢子形成。(A) Ku80、Delta;mogsk1和Delta;mogsk3/MoGSK1在26℃完全培养基(CM)上的菌落。接种后7天拍照。(B) Ku80、Delta;mogsk1和Delta;mogsk1/MoGSK1在Bar=50mu;m的载玻片上26℃诱导48h后光镜下分生孢子形成的比较。(C)乳酚苯胺蓝染色的空中

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