c型细胞色素还原活体腐败希瓦氏菌200的A悬液中Cr(VI)的原位光谱动力学外文翻译资料

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科学报告

标题：c型细胞色素还原活体腐败希瓦氏菌200的A悬液中Cr(VI)的原位光谱动力学

虽然c-type cytochromes (c-Cyts)介导金属还原的研究主要是利用体外纯化的异质金属还原菌蛋白，但由于难以测量完整细胞的蛋白，c-Cyts在体内的行为尚不清楚。本文中，由于对血红素的有着较强的吸收，因此利用扩散透射UV/Vis光谱成功地定量了活的腐败希瓦氏菌200 (SP200)中的c-Cyts，并研究了c-Cyts还原Cr(VI)的原位光谱动力学。在细胞表面观察到的还原产物Cr(III)可能起作用，16S rRNA分析表明，高浓度(gt;200 mu;M)的Cr(VI)能够抑制细胞，导致细胞数量的减少。建立c-Cyts氧化还原转化和c-Cyts还原Cr(VI)两种主要反应的动力学模型，但拟合曲线与c-Cyts数据不太吻合。因此在模型中加入Cr(III)对c-Cyts氧化还原转化细胞功能的抑制作用，这大大提高了模型拟合。本研究提供了在实际生理条件下，一个直接考察外膜反应性质的微生物金属还原过程中的膜酶。

异化金属还原菌(Dissimilatory metal reduction bacteria, DMRB)外膜(OM)^[1]中含有大量的c型细胞色素(c-Cyts)。在厌氧呼吸过程中，c-Cyts介导金属从细胞表面到终端电子受体(如有机物、电极和金属)的还原^[2,3]，这是缺氧地下环境中金属和微生物活动的生物地球化学循环的重要组成部分^[4,5]。在过去的20年里，许多研究使用全细胞、裂解液、细胞组分和蛋白质组学^[6-9]对希瓦氏菌或地杆菌的c-Cyts进行了检测。本文还研究了地杆菌的还原c-Cyts与各种金属的反应机理^[10]。此外，也有少数研究着重于从DMRB ^[11-14]中纯化OM c-Cyts的体外研究，从还原后的c-Cyts与金属的反应动力学观察。然而，在活细胞中纯化蛋白质和蛋白质复合物之间的氧化还原特性有很大的差异的高度活性的酶在纯化过程中很容易发生改变^[15]。由于嵌在脂质膜中的蛋白质可以作为一个整体并且在完整的细胞中起作用，它们的性质应该受到电子平衡的改变的影响^[15,16]。因此，对c-Cyts与金属反应的体内研究对于全面了解微生物金属还原过程具有重要意义。

由于c-Cyts的活性中心亚铁血红素具有较大的摩尔吸收系数，因此人们利用光谱方法来研究其体内性质^[15,17]。近年来，人们尝试利用消逝波光谱学和表面增强红外吸收等光谱方法来研究活细胞悬浮液中的c-Cyts^[18]。用原位光谱方法研究了氧化亚铁钩端螺旋体中Fe 3 与c-Cyts在好氧条件下的反应^[19]。紫外/可见吸收光谱法可以根据细胞的吸收来估计悬浮液中的细菌数量;然而，它在其他测量中的应用受到电池表面散射光量的限制^[15]。幸运的是，在使用扩散透射(DT)模式时，多血红素c-Cyts在整个细胞中的吸收光谱中没有观察到这种光谱干扰^[15]。最近，我们还采用了DT-UV/Vis光谱直接测量在一系列铁/腐殖质还原菌中还原或氧化c-Cyts ^[20-22]，完整细胞中c-Cyts的定量已根据众所周知的吸光度系数血红素进行。因此，利用DT-UV/Vis光谱对完整DMRB细胞内的反应进行原位光谱动力学分析，对于研究活细胞系统中微生物金属还原过程具有重要的应用价值。

由于Cr(VI)还原转化为Cr(III)是Cr(VI)污染的一种修复方法^[23]，且Cr(VI)易于用光谱法测定，故腐希瓦氏菌200(SP200)对Cr(VI)的还原反应是研究Cr(VI)和Cr(III)之间动力学是一种合适的模型来反应整个细胞中的金属离子和c-Cyts。虽然有大量的研究微生物减少Cr(VI)在细胞水平从动力学、路径、和中间产品^[8-10],但由于上述有限的方法测量c-Cyts明显动能，因此很少关注Cr(VI)之间的反应和c-Cyts在完整细胞。动力学建模方法是阐明整个基元反应机理的有力工具^[24]，对阐明微生物还原Cr(VI)的基元反应非常有用。然而，以往的动力学模型研究主要集中在含有已知分子的均相体系上^[25]，将其应用于微生物Cr(VI)还原的主要挑战在于深入了解临界酶与Cr(VI)之间的分子反应机制。考虑到微生物系统的复杂性和许多未知物种，将这些机制简化为一些主导反应可能是一个很好的开端的微生物还原Cr(VI)的模拟方法。由于完整细胞中Cr(VI)和c-Cyts的反应可以根据之前报道的机制通过一些非常清晰的化学反应来表现，因此建立一个简单的模型来描述完整细胞中c-Cyts还原Cr(VI)是非常可行的。

据我们所知，目前还没有报道完整细胞中Cr(VI)与c-Cyts的原位反应动力学，这导致从体内动力学角度对c-Cyts在微生物金属还原中的作用认识不足^[26-31]。此外,每一个基本反应的速率决定步骤和定量评估尚不明确,因此模型方法的原位观察动力学如上的解释基本的反应可能是非常有用的理解分子水平Cr(VI)和c-Cyts之间的反应机制。在此,本研究的目的如下:(1)量化生活中的c-Cyts SP200细胞悬浮液DT-UV / Vis光谱学,(2)原位监测Cr(VI)的变化和c-Cyts完整SP200细胞,(3)定量描述体内Cr(VI)之间的反应和c-Cyts使用动力学建模方法。

材料和方法

材料：SP200是一种异化铁还原菌^[9]，使用前在LB培养基中分批有氧培养至指数中期。马心脏细胞色素c和1,4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)购自Sigma化学公司(中国)。k2cr2o7(99%)购自美国Acros公司，未经进一步纯化而使用。

活SP200细胞悬液中c-Cyts的定量分析：细胞悬浮液的DT-UV/Vis光谱由UV/Vis分光光度计(TU-1901，北京，中国)和IS19-1积分球反射装置测量。光谱法只能直接测量位于细胞外膜非常表面的c-Cyts，而位于胞外质和细胞质膜的c-Cyts由于光不能穿透细胞膜而无法测量。因此，细胞悬液中测得的c-Cyts只能代表细胞外膜的c-Cyts。根据Picardal等^[9]，c-Cyts是存在于SP200外膜的重要的细胞色素，含有血红素蛋白^[8]。将SP200在30°C的营养液中有氧培养18 h 4℃，7000 g离心10 min，微球洗涤3次，再悬浮于无菌PIPES缓冲液(pH 7.0)中，光密度为1.2 (OD 600)，大约相当于1.5 times; 10 11个细胞Lminus;1。利用单分子含一个血红素的马心细胞色素c，从扩散透过率UV/Vis光谱中获得c- cyts中血红素的校准曲线(图S1a)，还原后的校准曲线斜率为25.68 mMminus;1(图S1b)。根据斜率值(25.68 mMminus;1)计算出SP 200悬浮液中c-Cyts的实际浓度(由血红素浓度表示)。

铬(VI)还原试验：Cr(VI)还原实验中，所有处理均使用原始细胞密度为1.5 times; 10 11细胞mLminus;1的完整SP200细胞悬液。采用SP200的浓缩细胞密度，缩短反应时间(lt; 1 h)，减少细胞生长对动力学计算的干扰;因此，细胞密度一般可以假定在整个反应期间是相同的。在30℃、180转/分的摇床上，将菌株在营养肉汤中有氧接种16 h，接近指数相时，使用PIPES缓冲液，在4℃、8000 times; g离心10 min，三次收集。将pipe缓冲液中的细胞悬浮液用100% n2清洗30 min，然后将20 mM乳酸作为电子供体的悬浮液加入光路长度为1.0 cm的矩形石英比色皿中测量，然后密封于厌氧室中。初步实验表明，添加乳酸后，c-Cyts在1 - 2分钟内完全还原，因此，初始的c-Cyts在厌氧试管中保持完全还原的形式。先测定不加入Cr(VI)的对照，再加入不同初始浓度的Cr(VI)，并每隔一段时间采集光谱。扫描波长为300 ~ 700 nm。Cr(VI)的特异性峰为373 nm，还原血红素的特异性峰为552 nm。在最佳条件下，将细胞暴露于1000 mu; M Cr(VI)下10 h，进行XPS分析。细胞在4°C, 10000 times; g离心5分钟后分离。用去离子水洗涤，在- 42°C的烤箱中冷冻干燥一夜。

提取含有OM c-Cyts的蛋白质的方法：采用含50 mM Tris-HCl、2 mM EDTA和5% Triton X-100的一步细菌蛋白提取试剂(BSP023，三工生物技术有限公司，上海，中国)，在pH 8.5条件下进行蛋白质的提取。将SP200细胞悬液在7000 g离心5分钟后加入蛋白提取试剂。15000 g离心5 min，得到含蛋白质的液体上清。所获得的蛋白质含有完全氧化形式的c-Cyts。c-Cyts的完全还原形式是通过添加过量的抗坏血酸钠来制备的。

16S rRNA基因测量方法：孵育约60 min后，7000 g离心4 min，液氮速冻，用TRIzol试剂(Invitrogen, USA)提取RNA，用逆转录PCR和Real-Time Quantitative PCR检测16S rRNA基因量。根据制造商的说明，使用PrimeScript II第一链cDNA合成试剂盒(Takara, Shiga, Japan)对获得的细菌RNA进行逆转录。采用iQ5 Real-Time PCR检测系统(Bio-Rid,USA), SYBR Green I检测方法对细菌16SrRNA转录本进行定量检测。qPCR系统采用Eub338 (ACTCCTACGGAGGCAGCAG) ^[32]和Eub518 (ATTACCGCGGCTGCTGG) ^[33]引物对。每个20 mu; L的反应溶液包含:1 mu; L的模板cDNA (1 - 10 ng)， 10 mu; L的2 times; IQ SYBR Green Supermix (Bio-Rid，美国)，每个引物0.2 mu; M。PCR条件为95°C 5 min, 94°C 20 s, 55°C 20 s, 72°C 30 s^[33]，共40个循环。每个DNA样本和一套适当的标准被重复运行。的qPCR 用连续三次10倍稀释的质粒DNA生成校准曲线。plamid pGEM-T Easy Vetor (Promega, Madison, USA)含有克隆的目标序列。质粒DNA提取使用EZNA质粒Mini Kit I (Omega Bio-Tek, Doraville, GA, USA)，浓度定量量子位2.0荧光计(Invitrogen, NY, USA)。根据标准曲线计算每个反应的目标拷贝数^[34]。

数值模拟：使用Kintek Explorer 程序对一系列实验条件下的实验数据进行了动力学模型拟合^[35]。为了从模型拟合范围中获得最优的k值，模型对个体速率常数值变化的敏感性也通过检测实验数据与动力学模型(定义为相对残差)之间的变化来评估。R)，当一个速率常数变化时，其他速率常数保持在最优值。使用Kintecus 程序评估动力学模型，使用VBA程序进行灵敏度分析^[36]。模型的灵敏度分析是通过运行模型，在一个速率常数变化的情况下，所有其他速率常数保持在其最优值不变，相对残差r，确定在每个速率常数的范围内的值。相对残差定义为式1。

其中，M i为给定系统条件和时间下的模型响应，D i为同一给定条件和时间下的实验数据，n为所有条件和时间下的测量数据点总数。r的值表示模型结果与实验数据的平均偏差，是模型再现实

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