固相萃取后用HPLC法测定糖蜜中糖的含量外文翻译资料

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固相萃取后用HPLC法测定糖蜜中糖的含量

摘要 以麦芽糖为内标，采用折射率检测器，采用高效液相色谱法同时测定甘蔗糖蜜中的果糖、葡萄糖和蔗糖。稀释后的样品和内标物的混合物用Sep-PakC18固相萃取法纯化，注射前通过0.22micro;m膜过滤。结果表明，果糖、葡萄糖和蔗糖的线性变化范围分别为3.30–16.48、1.80–9.02和5.94–29.70g/L，其平方相关系数(r2)分别为0.9986、0.9987和0.9955。该方法简单、定量、可用于测定甘蔗糖蜜中的糖含量，并可节省时间。

关键词 固相萃取；高效液相色谱法；甘蔗糖蜜；糖；内标品

引言

甘蔗糖蜜是甘蔗精炼的副产品，是一种粘稠而暗的糖浆，是由原汁中大部分蔗糖结晶和去除而成的。目前，中国每年的糖蜜供应总量为3亿-4亿吨。一般来说，糖蜜中按干重计算含有约50%的糖，主要是蔗糖、果糖和葡萄糖。此外，与精制糖不同，糖蜜含有微量的维生素和几种矿物质。由于其不寻常的特性，糖蜜被广泛用于烘焙，作为一种动物饲料添加剂，或作为一种发酵原料。因此，准确测定糖蜜中果糖、蔗糖和葡萄糖的含量对糖蜜的开发和有效利用具有重要意义。

测定糖的传统方法是偏振法或化学分析法，如测定总糖[1]的Lane-Eynon法和还原糖的DNS法。[2]测定糖蜜中糖类的经典方法和官方方法都需要相当长的时间，包含固有的误差，并基于经验推导的常数。[3]低聚糖的分析方法包括近红外光谱法、[4]薄层色谱法、气相色谱(GC)、[5]和高效液相色谱(HPLC)。[6,7]GC已被用于利用几种衍生化模式来分离碳水化合物。自碳水化合物的波动是由极性羟基、氨基和羧基，这些组的衍生化可以大大增加碳水化合物的波动，但通常的挑战GC是多个峰的出现由于互变异构体形式的还原糖。气相色谱法在测定低糖浓度方面特别准确，但样品制备很耗时。HPLC方法可以用简单的样品制备直接测定低聚糖。因此，HPLC由于其对碳水化合物定量的普遍性、时间效率、准确性和选择性，是最有前途的糖分析方法之一。[8]的作者，如Nejib等人[9]和Sims，[10]报道了HPLC方法作为测定碳水化合物混合物中单个糖的建立和首选方法。

一般来说，碳水化合物不吸收紫外线(UV)和可见辐射，如果没有适当的事先衍生化，不会发射荧光，因为它们既不具有发色团也不具有荧光团。一些碳水化合物在180-220纳米区域吸收近紫外线辐射。然而，基于在这个范围内的吸收的测量，检测是非选择性的。但碳水化合物可以通过高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)来测量。[11]HPLC-ELSD具有较高的灵敏度，可采用梯度洗脱，但仅在低糖浓度下具有良好的重现性。高效脉冲安培检测阴离子交换色谱(HPAEC-PAD)是[12]低聚糖测定中最有用的技术之一。但安培检测的稳定性较差，新型电极材料不断被探索。高效液相色谱折射率检测仪(HPLC-RID)在恒速和光学元件温度控制方面取得了相当大的改进。因此，由于葡萄糖-RID方法对葡萄糖、果糖和蔗糖检测结果的可靠性，被广泛应用于碳水化合物分析和[13]。基于上述原因，本研究采用了HPLC-RID方法，以及安捷伦Zorbax碳水化合物柱。

虽然关于测定天然产物中碳水化合物HPLC的方法已经发表，但[14,15]内标(IS)法很少被使用。[16]AIS比外部标准(ES)更受青睐，因为IS可以消除在液相色谱中注入精确体积、流动相组成的变化以及柱老化的潜在变化等问题。在本研究中，选择麦芽糖作为麦芽糖作为糖的HPLC测定。

对于HPLC检测糖蜜，测试了不同的样品脱色和纯化预处理方法。这是必要的，因为在糖蜜中存在色素和氮化合物混合物，这可能会干扰检测，并可能缩短色谱柱的寿命。[18]本研究选择固相萃取(SPE)对样品进行清洗，并由计算积分器自动生成的峰面积计算结果。本研究旨在建立和应用简单的提取和分析条件，利用RID和氨基键硅柱通过HPLC鉴定和定量糖蜜中的碳水化合物。

材料和方法

1 仪表和试剂

HPLC系统包括1525型二进制泵，7725型手动采样器，2414型RID(水协会。，米尔福德，MA，美国)，和安捷伦氧化碳水化合物柱(250times;4.6mm内径，5micro;m)，保护有保护柱(12.5times;4.6mm内径)。UtimateTMXBNH2柱(250times;4.6mmI.D.，5micro;m)来自韦尔奇材料技术（上海）有限公司。UV2802sh型紫外-可见分光光度计购自UNICO（上海）仪器有限公司（美国）。TGL-19G离心机(5mL)由上海Anke有限公司（中国）提供。

HPLC级乙腈(A998-4)购自赛默飞世尔科学公司（美国），HPLC级甲醇购自Kermel化学试剂有限公司（天津，中国）。研究中使用的水是双去离子水(Milli-Q，密力博雷公司，马州米尔福德，电阻率为18.2M/cm)。糖蜜来自广州甘蔗工业研究所湛江甘蔗研究中心（中国广东省）。HPLC级糖标准品（蔗糖、果糖、葡萄糖和麦芽糖）由阿拉丁化学有限公司（中国）提供。

膜过滤器（0.22micro;m）购自膜膜公司（德国）。大孔树脂(SepliteLX-38、LXA-8、LX-17、XDA-8)来自西安镧科技有限公司（中国），树脂D101来自天津波鸿树脂技术有限公司（中国）。水公司9月-pakC18SPE墨盒(WAT020805)购买自水公司公司（米尔福德，马萨诸塞州，美国）。SPE柱经过2.0mL甲醇，然后经过4.0mL双去离水。

2 结果

将2.970g蔗糖、1.648g果糖和0.902g葡萄糖溶解于100mL水中，制备蔗糖、果糖和葡萄糖混合标准溶液，在minus;20◦C下稳定ge;6个月。将上述混合标准原液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL的混合标准原液移入5个2ml琥珀玻璃容量瓶中，然后分别用水配制，制备糖的工作溶液。将2.019g麦芽糖溶解在200mL去离子水中，制备麦芽糖(IS)溶液(10.095g/L)，在minus;20◦C下稳定ge;6个月。

将1.0mL的IS原液移液到5个2.0mL琥珀玻璃容量瓶中，分别用1.0mL的上述糖工作溶液配制到标记，制备校准标准溶液。在750mL乙腈中加入250mL去离子水，超声混均匀，得到流动相（75%乙腈）。

3 样品制备

使用线性校准方程是强制性的，因此糖浆需要被质量比稀释如下：50克糖浆称重，倒入250毫升玻璃塞锥形烧瓶，然后与水稀释到150克，然后均匀混合。用100ml的溶液测定Brix(Bx)。准确测量上述稀释后的糖蜜(26.7◦Bx)(1.0mL等分)，倒入10ml容量瓶中，用水稀释到刻度标记，作为工作糖蜜溶液。接下来，将4.0ml的工作糖蜜溶液和4.0ml的IS溶液加入10ml离心管中，彻底混合，按照以下步骤：

1. 直接注射-样品is溶液在注射前通过0.22micro;m膜过滤。
2. SPE清理样品解决方案通过激活Sep-PakC18SPE列这样：8mL样品解决方案首先倒入激活C18SPE盒，然后插入柱塞，丢弃初始3毫升洗脱液，并收集后续3毫升洗脱液，通过0.22micro;m膜之前HPLC在最佳色谱条件。
3. 大孔树脂脱色法-将3ml上述工作糖蜜溶液移入5mL离心管中，分别与50和100mg五种不同的大孔树脂(LX-38、LXA-8、LX-17、XDA-8和D101)混合。然后，用副膜密封离心管，在30◦C，150rpm的摇台中孵育3小时。吸附后，用TGL-19G离心机以12000rpm离心，离心10min。最后，将收获的1mL上清液用HPLC进行糖分析，2mL上清液用UV2802sh型紫外-可见分光光度计在波长为560nm时进行吸光度测定。样品上的脱色率（Dec）计算如下：

Dec =100(A₀-A)/A₀

其中，A0为工作糖蜜溶液的原始吸光度，A为经上述方法预处理过的工作糖蜜溶液的吸光度。

4 高效液相色谱法

糖（蔗糖、果糖和葡萄糖）的色谱分离和IS方法是用WatersHPLC系统以等晶模式实现的。样品在碳水化合物柱(250times;4.6mmI.D.，5micro;m)上进行分析，并配备了防护柱(12.5times;4.6mmI.D.)。柱和RID温度分别设置为30和35◦C。流动相由乙腈和水（75：25、v/v）组成，流速为1.0mL/min。注射量为10micro;L。峰值检测和集成使用微风色谱系统(沃特斯公司，米尔福德，MA，美国)。以麦芽糖作为IS，采用内联法进行定量。用流动相平衡柱后，将流速保持在1.0mL/min，并向色谱柱中注入10micro;L的标准溶液。用标准品测定样品-is溶液，每个样品-is溶液重复检测三次。每次实验结束时，用流动相清洗柱30min以上。

5 方法学验证

通过将五种浓度的校准标准溶液注入HPLC系统(10micro;L)，制备每种糖的校准曲线。线性回归校准曲线(y=ax b)基于五个点，其中包括0，代表每个糖的峰值面积比乘以的浓度(y)和每个糖校准标准(x)构建使用加权(1/x2)线性最小二乘回归作为数学模型。[19]采用信噪比（信噪比）法确定检测限(LOD)。.通过注入一系列已知浓度的稀释溶液，估计其为提供信噪比为3：1[20,21]的分析物的最低浓度。HPLC方法对每种糖（蔗糖、果糖和葡萄糖）的精度对“样品制备方法”所述的样品IS溶液进行分析精度，报告为RSD，计算公式如下：

RSD=SD/A_r

其中，Ar为各糖与IS的平均峰面积比，SD为响应的标准差。为了研究实验的回收率，将每个糖蜜样品中加入三种不同浓度的糖标准样品，然后按照“样品制备方法”所述对is样品溶液进行处理每个样品被注射到HPLC-RI中3次。

6 公式

色谱柱的容量因子(k)的计算公式如下：

k=(t_r-t_m)/t_m

其中，tR是样品组分从样品注入到最大峰值所需的时间，tM是一个没有在柱的固定相中保留的组分的保留时间。回收率的计算方法如下：

Recovery(%) =100(Cs-Cn)/Ca

式中，Cs为加标样品is溶液中发现的每种糖的浓度，Cn为未加工样品is溶液中每种糖的浓度，Ca为加标样品is溶液中添加的每种糖的浓度。

结果与讨论

1 两种样品预处理方法的比较

除了糖类外，甘蔗糖蜜还含有色素、氮类化合物和无机离子，如钾、钙、钠和镁。甘蔗糖蜜中的色素包括多酚类植物色素和生产过程中产生的色素，如还原糖分解引起的假黑素、还原糖与氨基酸之间的反应，以及加热过程中烧焦的蔗糖产生的焦糖色素。含氮化合物包括蛋白质、氨基酸和酰胺。这些物质的存在影响了糖的分离，特别是色素物质甚至容易污染色谱柱，降低了色谱柱的分离度和寿命。[14,18]尽管预处理和未预处理样品之间的糖峰形状差异不大，但色素在色谱柱中的长期积累可以降低柱的寿命。因此，需要在注射前对样品进行预处理。

本研究采用大孔树脂脱色法和Sep-PakC18SPE柱纯化法对甘蔗糖蜜样品进行了预处理。XDA-8树脂对糖蜜样品的脱色效果比其他树脂更为显著（数据未显示）。然而，大孔树脂法的含糖损失比SPE柱纯化法更显著，这影响了后续测量的准确性（见表1）。

表1样品预处理对糖蜜中糖类的影响

如表1所示，两种方法12月均为87%，但大孔树脂法的总糖损失（11.32%）是SPE法（0.69%）的17倍。样品-is溶液通过Sep-PakC18盒，该盒注入4.0mL甲醇和8.0mL水。样品中的色素和多酚等物质被装到Sep-PakC18盒中，但糖由于亲水性较强而未被吸收，表明色素、多酚和脂质等物质可以被去除。综上所述，SPE清除方法具有较高的变色效率，较低的糖损失和更好的色谱峰分离。因此，本研究采用SPE法去除糖蜜样品中的干扰物.

2 色谱柱的选择

色谱分离柱是HPLC方法的核心，它直接影响到成分的分辨率和分析结果。比较了安捷伦Zorbax碳水化合物柱和UtimateTMXB-NH2柱对碳水化合物材料的分离和测定。如表2所示，三种糖在碳水化合物柱上的保留时间逐渐增加，说明时间间隔适中，分离效果好，而果糖和葡萄糖在XB-NH2柱上的保留时间太近，不能很好地分离。对于柱的容量系数(k)，容量系数越大，固定相固定的组件容量越大，说明组件从柱中流动较慢，保留时间较长.如果同一柱上两个组件的容量系数差异较大，则两个组件在同一柱上的保留时间差异可能显著，从而导致两个组件的分离更好。如表2所示，碳水化合物柱上的三种糖的容量因子(k)均大于XB-NH2柱上的三种糖。此外，当使用普通氨基进行时柱(XB-NH2柱)，它经常导致席夫碱的形成（糖和固定相的胺基之间的反应），这可能对色谱的固定相有显著影响（胺基的损失，不能再生）。结合在固定相表面的糖不

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