基于CRISPR-Cas13e的核酸检测系统的开发
（一）立项依据
新冠疫情的爆发已经造成了全球近亿人感染，数百万人死亡，对全球经济造成了灾难性地破坏。作为确定新冠病毒感染者的主要手段，快速、准确、灵敏的核酸检测手段在疾病诊断和监测方面起到了至关重要的作用。然而，现存的核酸检测方法在灵敏度，特异性，简单性和速度之间进行了权衡，因此，开发更好的核酸检测方法具有重大意义。
成簇的，规律间隔的短回文重复序列（CRISPR），和CRISPR相关蛋白（Cas）是自然界原核微生物中广泛存在的抵御外源遗传物质的的适应性免疫系统，它通常包含可编程的核酸内切酶，因此可以被用于开发基于CRISPR的核酸检测系统（CRISPR-Dx）[1, 2]。
CRISPR-Cas系统按照效应元件的组成可分为两大类。第1类CRISPR-Cas系统需要通过多种Cas蛋白组成的复合物和引导RNA行使功能，按照复合物中元件不同可以分为I、III和IV三种亚型[3]。第2类则只需要单个效应蛋白和引导RNA就可行使功能，按照效应蛋白的酶活结构域不同可分为II、V 和VI三种亚型，它们相应的效应蛋白分别被命名为Cas9，Cas12和Cas13[4]。由于第2类CRISPR-Cas系统更高效简洁，因而成为了基因编辑等实际应用中的主要工具来源。
Cas9是最早被发现的第2类CRISPR-Cas 系统，它包含HNH和RUVC 两个核酸酶结构域，分别负责切割双链DNA的靶标链和非靶标链[5]。Cas9需要一条与靶DNA序列互补的crRNA小分子和一条可结合crRNA的tracrRNA共同激活，通过PI结构域识别双链DNA靶标的3rsquo;端PAM后发挥切割功能。Cas9家族按照基因座结构和亲缘关系又可以分为II-A，II-B，II-C三类[3]。
Cas12是多样性最丰富的第2类CRISPR-Cas系统，它包含了11 个成员（Cas12a-k）。Cas12蛋白缺乏HNH核酸酶，但具有一个RuvC核酸酶结构域。大部分Cas12都可以对双链DNA进行靶向切割，并识别双链DNA的5rsquo;端PAM[6-10]。其中，Cas12a和Cas12b等蛋白在crRNA引导下与靶序列结合后对周围的单链DNA产生了很强的非特异性切割活性，由于这一特性，Jennifer A. Doudna等实验室开发了基于Cas12a的DETECTR，基于Cas12b的CDetection，STOPCovid等新型核酸检测技术[11-16]。
Cas13家族蛋白的主要功能是负责切割RNA，它含有两个保守的HEPN结构域。目前已知的Cas13包含四个家族，分别为Cas13a、Cas13b、Cas13c和Cas13d[17, 18]。与传统的RNAi和CRISPRi技术相比，CRISPR-Cas13系统在哺乳动物细胞中表现出了更高效的RNA 靶向切割活性，同时具有更少的脱靶切割[19]。然而大部分Cas13蛋白分子量仍然太大，例如Cas13a、Cas13b、Cas13c均具有超过1,100个的氨基酸残基，因此难以将他们的编码序列与crRNA一起共同包装入常用的腺相关病毒（adeno associated virus，AAV）的基因治疗载体。Cas13d是蛋白分子量最小的Cas13家族，平均包含950个氨基酸，使得它可以被包装于AAV载体中，并且在小鼠疾病模型中展现了不错的编辑效果[20, 21]。然而基于dCas13d和腺苷脱氨酶结构域ADAR2dd的单碱基编辑器dCas13d-ADAR2dd体积太大，难以用单个AAV载体进行装载[21, 22]。与Cas12家族类似，当前已知的Cas13蛋白在被基于crRNA的靶序列识别激活时，均具有非特异性RNA 酶活性。这种旁切效应在Cas13a和Cas13b中特别高，在Cas13d中也可以非常明显[23]。Cas13的旁切活性使其在核酸检测领域很受青睐，张锋实验室将Cas13a与等温扩增技术结合，开发了高灵敏度，高特异性的核酸检测系统SHERLOCK[24-27]。
DETECTR，SHERLOCK等方法的成功开发表明，基于CRISPR的核酸检测系统在灵敏度，特异性和简便性上优于传统核酸检测方法[12, 26]。然而，这些新型检测系统的核心基础专利却被欧美国家所垄断，这有可能给我国未来应用新型核酸检测系统进行疾病诊断和监测带来过高的成本。综上所述，应用我国拥有完全自主知识产权的基因编辑工具开发我们自己的新型核酸检测系统是我国疾病诊断领域的迫切需求。因此，本项目将以我们实验室自主挖掘的RNA编辑工具Cas13e为突破口，开发一种兼具高灵敏度，高特异性和易用性的核酸检测系统。
（二）研究内容和研究手段
