研究背景
类胡萝卜素属于萜类物质，以异戊二烯为基本骨架，是自然界普遍存在的由植物、藻类和微生物合成的的色素。类胡萝卜素是一个大家族，被广泛应用于医药、化妆品、食品等领域[1]。其中的beta;-胡萝卜素具有很好的抗氧能力，是合成人体维生素 A的前体物质。它对于增强人体免疫力，预防慢性疾病，延缓衰老以及有效抑制癌细胞的增殖等都具有重要意义[2]。目前，生产beta;-胡萝卜素的方法主要有通过植物或藻类直接提取法、化学合成法和微生物发酵法等，但各有其限制因素[3]。近年来，以代谢工程为基础，大肠杆菌或酿酒酵母作为工程菌大量合成beta;-胡萝卜素的模式研究有很大的进展。该方法相对于传统的方法，不仅节省了时间，更加符合现今人们对于天然产物的追求。
通过一系列的异戊二烯化合物合成，其前体物是异戊二烯焦磷酸 (IPP)，共有 2 条合成途径即甲羟戊酸 (MVA) 途径和 2-甲基-D-赤藻糖醇-4- 磷酸(MEP)途径。E. coli 及其他原核生物通过 MEP 途径缩合丙酮酸 (Pyruvate) 和甘油醛-3- 磷酸 (G3P) 为 IPP；真核细胞、细胞质以及 植物线粒体利用 MVA途径转换乙酰辅酶 A生成 IPP。HMG-CoA还原酶（HMGR）和异戊二烯焦磷酸异构酶（LDI）是甲羟戊酸 (MVA) 途径合成的beta;-胡萝卜素的前体两个限速酶，可通过增强这两个限速酶的表达来提高beta;-胡萝卜素的产量[3]。
CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术是Guide-RNA和Cas蛋白结合形成复合体, 复合体起导向作用, 引导核酸酶Cas9蛋白在靶位点上剪切双链脱氧核糖核酸, 从而完成通过CRISPR技术对DNA的定点切割[4]，在 DNA 内部形成双链断裂（Double strand break，DSB）。大部分真核细胞中存在内源的 DNA 损伤修复机制，形成的 DSB 可以通过两种方式修复，分别是非同源末端连接（Non-homologous end joining，NHEJ）和同源重组修复（Homology directed recombination repair，HDR）。在存在同源序列（外源的供体 DNA 或内源的染色体）的情况下，同源重组修复（HDR）可以接到供体 DNA将 DSB 修复[5]。
本研究旨在引入外源beta;-胡萝卜素合成通路，构建合适的可生产相当产量的beta;-胡萝卜素的工程菌株，有利于后续对beta;-胡萝卜素生物合成的两个的限速酶LDI和HMGR的优化。
国内外研究现状
近几年来有不少研究人员通过工程改造微生物致力于beta;-胡萝卜素的合成优化。大肠杆菌和酿酒酵母是最常使用的工程菌，又以大肠杆菌最受研究人员青睐。大肠杆菌体内存在合成beta;-胡萝卜素前体IPP的MEP途径。但大肠杆菌体内并没有直接合成beta;-胡萝卜素的代谢通路，需要利用基因工程引入合适的外源beta;-胡萝卜素合成基因。野生菌——欧文氏菌,成团泛菌和三孢布拉氏 霉菌中均含有 beta;-胡萝卜素的结构基因——crtEYIB 基因簇[3]。Yoon等将肺炎链球菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌和酿酒酵母的MVA途径下游通路导入大肠杆菌中，发现含有肺炎链球菌MVA途径的大肠杆菌产生的beta;-胡萝卜素量最高。同时对MVA途径的上游部分进行了比较，发现粪肠杆菌的MVA途径上游是产生甲羟戊酸最有效的途径。他们将前者MVA途径的下游部分与后者的上游部分结合构建新的MVA途径与外源beta;-胡萝卜素合成基因导入大肠杆菌中，在不添加外源甲羟戊酸的培养条件下，重组菌株也能产生相当量的beta;-胡萝卜素[6]；过表达异戊二烯焦磷酸异构酶(idi)可以提高异戊二烯的产量[7]。刘敏等通过传统PCR方法扩增了大肠杆菌IPP异构酶基因idi和枯草芽孢杆菌IPP异构酶基因FNI，并在大肠杆菌 BL21(DE3)中异源过量表达，结果表明两种异构酶均能够促进工程菌beta;－胡萝卜素的合成，且来自枯草芽孢杆菌的FNI基因效果更好[8]；Yang等优化了枯草芽孢杆菌MEP通路的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶 (Dxs)和异戊烯焦磷酸异构酶FNI、大冷杉香叶酰二磷酸合成酶(GPPS2)，，同时将MVA途径引入工程菌株中共表达。使得 beta;-胡萝卜素产量达到 3.2 g/L[9]；杰能科 (Genencor) 的研究发现，过表达 DXS、IDI 和葛根 ispS 的工程大肠杆菌异戊二烯产量达到 300 mg/L，相比于只过表达了 ispS 基因的大肠杆菌，异戊二烯产量提高了5–12倍[10]；Li 等利用 CRISPR/Cas9 的方法对E. coli 中的MEP途径的15个基因进行改造和组合调控，并调节了中心碳流量，beta;-胡萝卜素的产量达到 2.0 g/L[11]；Pitera 等在研究中发现，虽然在大肠杆中异源表达 MVA 途径可以提萜类物质的产量，然而细胞内中间谢产物 HMG-CoA的大量积累会抑制细胞的生长，通过调节HMGR 的表达量可以解决谢途径中的瓶颈限制提高上游途径的 MVA 产量[12]。
研究目标
利用基因工程技术向E．coli中引入beta;-胡萝卜素合成基因并通过测定其产量筛选出最优菌株以对工程菌beta;-胡萝卜素的生物合成进行优化
