课题名称：
改造天冬酰胺途径与四氢嘧啶的生物合成研究过程中基于AraC调节蛋白的生物感受器构建。
研究意义及目的：
一些细菌如嗜盐或耐盐性微生物在生长过程中，当外界环境的渗透压发生变化时，细胞为了抵御这种环境渗透压带来的损害，会通过自身合成以及从环境中吸收小分子物质两种方式来对内外渗透压进行相应的调节[1]。其中，以天冬氨酸代谢支路为途径合成的四氢嘧啶作为最普遍存在的相容性溶质之一具有很多作用，因而成为研究的热点。天冬酰胺途径的产物四氢嘧啶不仅是微生物细胞的能源物质、渗透压调节物质，还是细胞及大分子物质的生物保护剂，可以缓解高渗、高温、冻融、干燥、辐射[2]和化学试剂对蛋白、核酸、生物膜及整个细胞的毒害作用。四氢嘧啶是所有已知的相容性溶质中对生物细胞及大分子物质保护效果最好的，近年来它在酶工业领域稳定酶分子结构、医疗领域应用于阿尔兹海默病、HIV病毒感染[3]等疾病的治疗以及在化妆品领域抗氧化、防止紫外线伤害、保护皮肤水润、恢复皮肤弹性活力、减缓皮肤的衰老的应用也日益受到关注[4]。AraC调节蛋白可被底物四氢嘧啶变构，继而调节报告基因的表达，将工程菌生长过程中产生的四氢嘧啶化学信号转为可检测信号，从而实现实时在线显示产物产量[5]。
四氢嘧啶可通过化学合成法进行合成，但其产率低，同时产生的副产物会对其合成造成影响；而四氢嘧啶的发酵生产虽然产率相对来说提高了不少，但整个发酵过程对营养物质及培养条件有着十分高的要求，成本颇高[6]，于是将代谢工程引进，研究其代谢调控，提高了制备效率，是具有重要意义和应用价值的。四氢嘧啶的生物合成路线是从L-天冬氨酸-b-半醛开始的，合成中参与的酶有三种，分别是二氨基丁酸乙酰基转移酶（EctA）、二氨基丁酸氨基转移酶（EctB）以及四氢嘧啶合成酶（EctC）。合成路线为底物L-天冬氨酸-beta;-半醛经二氨基丁酸氨基转移酶的转氨基作用合成L-2，4-二氨基丁酸（DABA），然后在二氨基丁酸乙酰基转移酶的作用下合成N-乙酰-L-2，4-二氨基丁酸（ADABA），最后在四氢嘧啶合成酶的环化作用下得到产物四氢嘧啶[7]。
AraC蛋白突变体能够特异性结合四氢嘧啶并受其诱导开启启动子表达下游报告基因，建立报告基因表达强度和四氢嘧啶浓度之间的对应关系，筛选高产四氢嘧啶的菌株。这是一种为四氢嘧啶高产菌株的筛选提供一种快速高效的高通量筛选方法[5]，可以促进四氢嘧啶工业化应用的发展。
蓝白筛选是一种用来筛选重组克隆的方法。这种方法所选用的基因工程菌为beta;-半乳糖苷酶缺陷型菌株，它能编码合成半乳糖苷酶的羧基端的omega;片段，但氨基端失去了146个氨基酸（alpha;片段），而所选用的载体含有可编码合成半乳糖苷酶氨基端alpha;片段，当这两种独立存在时，并不会编码合成含有活性的半乳糖苷酶，只有将载体整合入该种菌体内才能合成半乳糖苷酶。合成的具有活性的半乳糖苷酶可以将底物X-gal分解成带有蓝色颜色的物质。当目的基因与载体连接时，其片段会插入到位于载体上lacZrsquo;中的多克隆位点，此时alpha;片段读码框被破坏，导致基因不被表达，beta;-半乳糖苷酶不能被合成，在结果中呈现为白色菌种[8]。
国内外相关研究：
