一、选题依据
大豆异黄酮为豆科植物大豆Gly cine max ( L. )Merr . ( P haseolus max L. ) 的提取物。近年来国内外研究表明, 大豆异黄酮有预防癌症、防止骨质疏松、防止心血管疾病、抗炎、抗菌、抗衰老、抗氧化、降低糖尿病患者血糖水平以及防止酒精中毒等生理活性。
异黄酮在自然界中的分布只局限于豆科的蝶形花亚科等极少数植物中, 如大豆、墨西哥小白豆(garbaanzo beans) 、苜宿(clover) 和绿豆(green pea) 等植物中。其中异黄酮含量高的只有苜宿和大豆,一般苜宿中异黄酮的含量为0.5 %～3.5 % ,大豆中异黄酮含量为0.05 %～0.4 % ,异黄酮的含量与植物的产地、生长条件以及生长期有关。据日本科研人员从免疫学调查和骨质密度与异黄酮摄取关系推算,成人每日异黄酮摄取量至少应在30 - 40mg。但自然界中异黄酮的资源十分有限,在含量最高的大豆中所含的异黄酮也仅为0. 1 %- 0. 5 %。
采用转基因的方式，使大豆异黄酮基因在烟草中表达，以获得大豆异黄酮的来源。烟草通过转基因后，由于变异等非自然因素的存在，烟草是否表达该基因以及表达优劣无法从外观上进行判断。目前没有成熟的测定方案直接对该烟草进行含量测定，故本课题通过建立提取、含量测定、方法学验证的方法来检测转基因后的烟草的表达情况。
二、实验目的
- 寻找合适的提取方法提取烟草中的染料木素。
- 设计用反相HPLC色谱法测定染料木素的最佳色谱条件。
- 进行方法学验证。
- 对提供的20份样品进行含量测定，为转基因烟草的研究提供依据。
三、实验方法
1.寻找合适的提取方法
由于烟草中含有的大豆异黄酮量很少，所以怎么提高大豆异黄酮的提取率是很关键的。目前最常用的提取大豆异黄酮的方法是采用乙醇加热回流的方法，但是该法时间长，杂质溶出物较多。转基因烟草中所含的染料木素及染料木苷的量极少，所以考虑在提取过程中就将染料木苷转化为染料木素，以方便进行含量测定。参考相关文献，主要有酸法水解和酶法水解染料木苷两种方法。考虑到实际操作时，酶类所受影响因素较多，不易控制，操作难度较大，于是采用酸法水解。转化率基本达到100%。选用不同的溶剂如乙酸乙酯、叔丁基甲醚等进行进行提取，比较提取后所得结果选取合适的提取溶剂；选用不同是稀释液如甲醇：MP=1:1或MP等分别稀释系列浓度的标准品，进样后，比较保留时间、峰高、峰面积的结果，选用合适的稀释液。
参考相关文献，采取以下提取流程：
(1) 准确称取10g植物材料，在液氮中研磨粉碎，加入100ml 80%甲醇于28℃摇床震荡24h；
