开题报告
研究目的与意义
他克莫司软膏是临床上一种常用的免疫抑制剂；其0.03%规格可适用于临床上2岁以上的儿童；其作用机理为在分子水平，他克莫司的作用显然是利用与细胞性蛋白质（FKBP12）相结合，而在细胞内蓄积产生效用。FKBP12-他克莫司复合物会专一性地结合以及抑制calcinurin，其会抑制T细胞中所产生钙离子依赖型讯息传导路径作用，因此防止不连续性淋巴因子基因的转录。本药是具有高度免疫抑制的药物，其活性在体外及体内实验中都已被证实。本药抑制形成主要移值排斥作用之细胞毒性淋巴球的生成。本药是具有高度免疫抑制的药物，其活性在体外及体内实验中都已被证实。本药抑制形成主要移植排斥作用之细胞毒性淋巴球的生成。本药抑制T细胞的活化作用以及T辅助细胞依赖B细胞的增生作用。也会抑制如白介素-2、白介素-3及gamma;-干扰素等淋巴因子的生成与白介素-2受体的表达。在分子水平，本药的效应似乎是由结合到细胞性蛋白质（FKBP）所产生，此蛋白质也会造成该化合物累积在细胞间。在体内试验中发现，本药显示出对肝脏及肾脏移植有效。
他克莫司软膏含量测定较为复杂，目前没有被中国药典收载，国内外可供参考的相关文献较少，为提高他克莫司软膏质量的可控性，确保药品安全有效，本实验拟采用高效液相色谱测定对含量进行测定。
问题及拟解决方案：
他克莫司软膏含量测定方法具有一定的操作难度，主要表现在样品处理方法上，本品规格（0.03%）较小，如何选择合适的处理方法保证本品含量测定的均匀性是一大难点，另外由于本品剂型为软膏剂，辅料多为白凡士林、液体石蜡等黏状半固体，使得本品成分较为复杂，供试品溶液配制过程中，需加入大量的有机溶剂保证他克莫司的溶解，在此过程中可能会有部分溶解性辅料被带入供试品溶液中，对含量测定方法的专属性具有一定的挑战。
通过调研国内外他克莫司软膏相关注册标准，其中收载软膏检测标准的有进口注册标准、美国药典论坛标准及国内浙江万马药业注册标准，罗列的色谱条件及供试品处理方法如下表：
表1 他克莫司软膏含量测定方法比较
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软膏进口注册标准JX20130245 |
美国药典论坛USP-PF-43(3)软膏 |
浙江万马药业标准 YBH03172013 |
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色谱条件 |
流动相：水-异丙醇-四氢呋喃（5:2:2）； 色谱柱：C18柱； 波长：220nm； 柱温：55℃； 进样体积：20mu;l； |
流动相A：1.36g/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH值至2.5）； 流动相B：乙腈； 色谱柱：YMCODS-AQC184.60mmtimes;300mm，3mu;m；波长：200nm； 柱温：60℃；流速：1.4ml/min； 进样体积：50mu;l； 洗脱程序：
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流动相：水-异丙醇-四氢呋喃（5:2:2）； 色谱柱：C18柱； 波长：220nm； 柱温：55℃； 进样体积：20mu;l |
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供试品处理方法 |
将一管他克莫司软膏的内容物转移至一预先冲洗过的广口玻璃瓶中，混匀。精密称取供试品约1.0g，置50ml锥形瓶中，加入12.0ml四氢呋喃，密闭条件下在60℃水浴加热，同时振摇或磁力搅拌至软膏溶解，加入4.0ml水，小心振摇至形成混悬液，置冰浴中冷却10分钟，平衡至室温，加入无水乙醇2.0ml和内标溶液2.0ml，剧烈振摇30秒，以孔径0.45m的滤膜过滤，取续滤液，密闭，室温静置4小时，作为供试品溶液。 |
取他克莫司软膏约3g，置60ml分液漏斗中，，加入正己烷20ml，振摇使分散（至少15min），加溶剂10ml，振摇5min，静置至少10min使分层。取下层清液和上层浑浊液下的气泡置25ml量瓶中；再加溶剂6ml至分液漏斗内，进行提取，并收集下层清液至上述25ml量瓶内，此步骤重复两次；将收集的溶液用溶剂定容至刻度。如果量瓶中上层有正己烷存在，用溶剂稀释分层处至刻度线，混匀，静置10min，用玻璃注射器吸取下层溶液至有特氟龙涂层的液相进样瓶内，于5℃放置。 |
将一管他克莫司软膏的内容物转移至一预先冲洗过的广口玻璃瓶中，混匀。精密称取供试品约1.0g，置50ml锥形瓶中，加入12.0ml四氢呋喃，密闭条件下在60℃水浴加热，同时振摇或磁力搅拌至软膏溶解，加入4.0ml水，小心振摇至形成混悬液，置冰浴中冷却10分钟，平衡至室温，加入无水乙醇4.0ml，剧烈振摇30秒，以孔径0.45m的滤膜过滤，取续滤液，密闭，室温静置4小时，作为供试品溶液。 |
结论：进口注册标准JX20130245与浙江万马药业标准YBH03172013中样品处理过程基本一致，但测定方法中进口标准采用内标法进行计算，在预试验的过程中，发现仅采用外标法计算时，由于本品溶剂中四氢呋喃的含量较大，较易挥发，若采用样品室低温（15℃），样品经过0.45mu;m或者0.22mu;m滤过后依然会析出絮状物，会影响进样的准确性，采用进口方法以内标法进行计算，可避免该问题的发生；USP-PF-43(3)方法中含量与有关物质采用的同一方法，运行时间较长且样品处理较为繁琐，故不选用该方法。估本品的含量测定方法在进口注册标准基础上进行筛选。同时对选择的含量测定方法进行方法学验证，验证项及合格标准如下：
表2 含量测定方法验证项及合格标准如下
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项目 |
要求 |
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专属性 |
溶剂、空白辅料不干扰他克莫司及内标物出峰；各降解条件下，他克莫司峰纯度与内标物峰纯度符合规定，各峰间的分离度符合规定。 |
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系统适用性 |
连续进样6次，他克莫司峰与内标物峰之间的分离度应不小于6；理论板数按他克莫司峰计算应不低于3000；拖尾因子按他克莫司峰计算应不大于1.5；他克莫司峰面积的RSD不得过2.0%。 |
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溶液稳定性 |
对照品及供试品在检测时间范围内峰面积保持稳定 |
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线性与范围 |
相关系数R＞0.999。 |
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精密度 |
重复性和中间精密度测定符合规定 |
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准确度 |
高中低浓度回收率范围应在98%~101%范围内。 |
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提取方法耐用性 |
考察供试品溶液配制中水浴温度有微小变动时，对含量测定结果影响。 |
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耐用性 |
考察柱温、流速、检测波长、流动相比例、色谱柱等条件发生微小变动时，对含量测定结果影响 |
文献综述：
一、他克莫司的药理作用以及来源
他克莫司是一种钙调磷酸酶抑制剂，主要是通过抑制T细胞活化 相关细胞因子（ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＦＮ-gamma;、ＴＮＦ-alpha;、ＧＭ-ＣSF）的转录和ＩＬ-２、ＩＬ-７受体的表达发挥免疫抑制作用[1]，最初是由日本从tsukubaensis链霉菌（一种类似真菌的细菌，由Tsukuba在土壤样本中发现）的发酵培养基中分离而得[2，9]。
- 他克莫司的临床应用
1.器官移植后的抗排异治疗
在临床上，他克莫司主要用于肝肾等器官移植后的抗排异治疗，可以降低患者的急性排斥反应发生率和再次移植率,并减少类固醉激素的用量，表现在急性耐皮质类固醇性、难治性急性和慢性排斥反应的低发生率上，在排斥反应减少的同时，皮质类固醇激素的用量也明显减少[3]。
2.治疗特异性皮炎
研究表明[4]，他克莫司对特应性皮炎患者T淋巴细胞亚群因子水平改善效果显著，对特应性皮炎患者NK细胞水平也具有显著的改善作用，而且他克莫司治疗特应性皮炎的疗效显著，可有效缩小湿疹面积，降低严重程度，用药安全性较高。
3.治疗银屑病
银屑病是一种慢性反复发作性以红斑鳞屑为主要临床表现，以角质形成细胞过度增殖、大量炎性细胞浸润为主要病理特征的皮肤病[5]。他克莫司可以抑制角质形成细胞PAR-2的表达以治疗银屑病。尤其对于皮肤薄嫩部位、特殊部位银屑病和儿童银屑病，治疗效果突出，且安全性及耐受性好[6]。
4.改善脑缺血患者的神经功能
慢性脑缺血是指各种原因引发的长期脑血流量灌注不足。目前研究表明，长期的慢性脑缺血是形成血管性痴呆的重要因素之一。张丽藏等[7]通过对脑缺血大鼠学习记忆功能的研究，发现他克莫司可改善大鼠脑缺血后学习记忆能力
5.治疗风湿免疫病
基于他克莫司抑制免疫的药理作用，目前用于风湿免疫类疾病如难治性狼疮肾炎(LN)，系统性红斑狼疮(SLE)，类风湿性关节炎(RA)等的治疗，并取得了良好的临床效果[8]。
参考文献
[1]杨梦,左笑丛,汪江林,陈清洁.他克莫司药效学研究进展[J].中国临床药理学与治疗学,2014,19(01):90-95.
[2]吴娜,史爱欣,傅得兴.他克莫司软膏的药理及临床评价[J].药物不良反应杂志,2007(01):62-66.
[3]逄晓云.他克莫司的药理作用及临床应用[J].中国药师,2006(05):462-463.
[4]崔乐.他克莫司治疗特应性皮炎的效果及对患者免疫功能的影响[J].保健医学研究与实践,2020,17(02):45-48.
[5]张占平,王禄,郝勇.他克莫司软膏在银屑病治疗中的应用[J].中国实用医药,2015,10(04):124-125.
[6]吕莉,陈敬.银屑病治疗的研究进展[J].河北医药,2017,39(23):3643-3647.
[7]张丽藏,李文杰,李若禹,闫彩珍,苏素文,王可欣.他克莫司对脑缺血大鼠学习记忆功能的影响及其机制分析[J].中国药师,2021,24(03):432-437.
[8]马祝悦,姚瑶,方芸.他克莫司在风湿免疫病中应用的研究进展[J].药学与临床研究,2017,25(02):137-141.
[9]Matsuura Yoshiaki,Nomura Naohiro,Shoda Wakana,Mori Takayasu,Isobe Kiyoshi,Susa Koichiro,Ando Fumiaki,Sohara Eisei,Rai Tatemitsu,Uchida Shinichi. Tacrolimus ameliorates the phenotypes of type 4 Bartter syndrome model mice through activation of sodium-potassium-2 chloride cotransporter and sodium-chloride cotransporter.[J].Biochemical and biophysical research communications,2019.
资料编号：[369102]
开题报告
研究目的与意义
他克莫司软膏是临床上一种常用的免疫抑制剂；其0.03%规格可适用于临床上2岁以上的儿童；其作用机理为在分子水平，他克莫司的作用显然是利用与细胞性蛋白质（FKBP12）相结合，而在细胞内蓄积产生效用。FKBP12-他克莫司复合物会专一性地结合以及抑制calcinurin，其会抑制T细胞中所产生钙离子依赖型讯息传导路径作用，因此防止不连续性淋巴因子基因的转录。本药是具有高度免疫抑制的药物，其活性在体外及体内实验中都已被证实。本药抑制形成主要移值排斥作用之细胞毒性淋巴球的生成。本药是具有高度免疫抑制的药物，其活性在体外及体内实验中都已被证实。本药抑制形成主要移植排斥作用之细胞毒性淋巴球的生成。本药抑制T细胞的活化作用以及T辅助细胞依赖B细胞的增生作用。也会抑制如白介素-2、白介素-3及gamma;-干扰素等淋巴因子的生成与白介素-2受体的表达。在分子水平，本药的效应似乎是由结合到细胞性蛋白质（FKBP）所产生，此蛋白质也会造成该化合物累积在细胞间。在体内试验中发现，本药显示出对肝脏及肾脏移植有效。
他克莫司软膏含量测定较为复杂，目前没有被中国药典收载，国内外可供参考的相关文献较少，为提高他克莫司软膏质量的可控性，确保药品安全有效，本实验拟采用高效液相色谱测定对含量进行测定。
问题及拟解决方案：
他克莫司软膏含量测定方法具有一定的操作难度，主要表现在样品处理方法上，本品规格（0.03%）较小，如何选择合适的处理方法保证本品含量测定的均匀性是一大难点，另外由于本品剂型为软膏剂，辅料多为白凡士林、液体石蜡等黏状半固体，使得本品成分较为复杂，供试品溶液配制过程中，需加入大量的有机溶剂保证他克莫司的溶解，在此过程中可能会有部分溶解性辅料被带入供试品溶液中，对含量测定方法的专属性具有一定的挑战。
通过调研国内外他克莫司软膏相关注册标准，其中收载软膏检测标准的有进口注册标准、美国药典论坛标准及国内浙江万马药业注册标准，罗列的色谱条件及供试品处理方法如下表：
表1 他克莫司软膏含量测定方法比较
