开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
基因治疗是指将外源基因DNA或RNA通过载体等方式导入人体靶细胞，以纠正或补偿患者基因的缺陷,关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗疾病的目的。基因治疗除了应用于遗传缺陷疾病的治疗，又广泛的应用于后天获得性疾病的治疗，如肿瘤、自身免疫性疾病、器官移植等等。基因治疗从理论上来说可以根治许多疾病，当基因治疗从试验室走到临床试验上，基因治疗的一些意外又给基因治疗蒙上一层阴影。
目前的基因细胞治疗主要采用病毒（慢病毒，腺病毒，逆转录病毒，腺相关病毒）和非病毒（裸露DNA，脂质体，纳米载体）两种载体形式。根据数据统计，使用非病毒载体进行临床实验的项目大约占目前基因细胞治疗总数量的36.6%；其主要载体形式有质粒和脂质体等。而大部分的基因细胞治疗项目都是采用病毒作为载体形式，因为病毒可自然感染细胞，它本身就有一套机制可将基因送入细胞核表现，因此为一高效率的基因传送系统。在利用病毒时，通常是把某个病毒基因拿掉，然后以治疗基因取代而制备出具有感染力的病毒。但在设计任何一种病毒载体时，最重要的便是将病毒本身会致病的基因剔除，同时也须避免病毒发生突变而产生有传染力且会致病的病毒。
病毒导入人体内会产生病毒感染风险，如果病毒浓度把控不好会造成得不偿失，基因细胞治疗反而会给人体健康带来危害，所以当病毒作为基因细胞治疗载体时，对病毒浓度需要严格控制，因此测定病毒颗粒数非常必要。
病毒物理滴度测定方法VP（病毒颗粒）是测定病毒颗粒在相应波长处的吸光度（病毒DNA和蛋白的总吸光度中主要为DNA），1个OD值相当于1.1times;1012个病毒颗粒。通过病毒物理滴度的检测可以测出样本中病毒的浓度，判断样本中病毒浓度是否在合格范围区间内，从而对药物质量合格与否起到检验作用。
ELISA 原理 －－操作规则（新手适用） 一．实验目的 酶联免疫吸附测定（ enzyme-linked immunosorbent assay 简称 ELISA）是在免疫酶 技术（ immunoenzymatic techniques ）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技 术,ELISA 过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原） , 再加 相应酶标记抗体（抗原） , 生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复 合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的 量。待测抗体（抗原）的定量与有色产物成正比。 二．实验原理 用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶， beta; －Ｄ－半乳糖苷酶， 葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶， 6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于 ELISA 法的酶 有 辣根过氧化物酶 ，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是 氧化还原反应， 在呈色后须立刻测定， 否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定 量。 辣根过氧化物酶（ HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素 （protonhemin ）区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最 大吸收峰是 403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是 275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已 知 HRP的 A（ 1cm 403nm 1%）＝ 25，式中 1％指 HRP百分浓度为 100ml 含酶蛋白 1g，即 10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是 HRP的 A（1cm 403nm mg/ml=2.5 ）HRP纯度 （RZ）=A403nm/A275nm纯度 RZ（Ｒ einheit Zahl ）值越大说明酶内所含杂质越少。 高纯 度 HRP的 RZ值在 3.0 左右，最高可达 3.4 。用于 ELISA 检测的 HRP的 RZ值要求在 3.0 以 上。 ELISA 的基本原理有三条： （ 1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面 间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性； （ 2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持 其免疫学和酶学活性； （ 3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后ELISA 原理 －－操作规则（新手适用） 一．实验目的 酶联免疫吸附测定（ enzyme-linked immunosorbent assay 简称 ELISA）是在免疫酶 技术（ immunoenzymatic techniques ）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技 术,ELISA 过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原） , 再加 相应酶标记抗体（抗原） , 生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复 合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的 量。待测抗体（抗原）的定量与有色产物成正比。 二．实验原理 用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶， beta; －Ｄ－半乳糖苷酶， 葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶， 6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于 ELISA 法的酶 有 辣根过氧化物酶 ，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是 氧化还原反应， 在呈色后须立刻测定， 否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定 量。 辣根过氧化物酶（ HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素 （protonhemin ）区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最 大吸收峰是 403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是 275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已 知 HRP的 A（ 1cm 403nm 1%）＝ 25，式中 1％指 HRP百分浓度为 100ml 含酶蛋白 1g，即 10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是 HRP的 A（1cm 403nm mg/ml=2.5 ）HRP纯度 （RZ）=A403nm/A275nm纯度 RZ（Ｒ einheit Zahl ）值越大说明酶内所含杂质越少。 高纯 度 HRP的 RZ值在 3.0 左右，最高可达 3.4 。用于 ELISA 检测的 HRP的 RZ值要求在 3.0 以 上。 ELISA 的基本原理有三条： （ 1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面 间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性； （ 2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持 其免疫学和酶学活性； （ 3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后ELISA 原理 －－操作规则（新手适用） 一．实验目的 酶联免疫吸附测定（ enzyme-linked immunosorbent assay 简称 ELISA）是在免疫酶 技术（ immunoenzymatic techniques ）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技 术,ELISA 过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原） , 再加 相应酶标记抗体（抗原） , 生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复 合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的 量。待测抗体（抗原）的定量与有色产物成正比。 二．实验原理 用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶， beta; －Ｄ－半乳糖苷酶， 葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶， 6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于 ELISA 法的酶 有 辣根过氧化物酶 ，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是 氧化还原反应， 在呈色后须立刻测定， 否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定 量。 辣根过氧化物酶（ HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素 （protonhemin ）区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最 大吸收峰是 403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是 275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已 知 HRP的 A（ 1cm 403nm 1%）＝ 25，式中 1％指 HRP百分浓度为 100ml 含酶蛋白 1g，即 10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是 HRP的 A（1cm 403nm mg/ml=2.5 ）HRP纯度 （RZ）=A403nm/A275nm纯度 RZ（Ｒ einheit Zahl ）值越大说明酶内所含杂质越少。 高纯 度 HRP的 RZ值在 3.0 左右，最高可达 3.4 。用于 ELISA 检测的 HRP的 RZ值要求在 3.0 以 上。 ELISA 的基本原理有三条： （ 1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面 间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性； （ 2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持 其免疫学和酶学活性； （ 3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后ELISA 原理 －－操作规则（新手适用） 一．实验目的 酶联免疫吸附测定（ enzyme-linked immunosorbent assay 简称 ELISA）是在免疫酶 技术（ immunoenzymatic techniques ）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技 术,ELISA 过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原） , 再加 相应酶标记抗体（抗原） , 生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复 合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的 量。待测抗体（抗原）的定量与有色产物成正比。 二．实验原理 用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶， beta; －Ｄ－半乳糖苷酶， 葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶， 6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于 ELISA 法的酶 有 辣根过氧化物酶 ，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是 氧化还原反应， 在呈色后须立刻测定， 否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定 量。 辣根过氧化物酶（ HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素 （protonhemin ）区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最 大吸收峰是 403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是 275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已 知 HRP的 A（ 1cm 403nm 1%）＝ 25，式中 1％指 HRP百分浓度为 100ml 含酶蛋白 1g，即 10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是 HRP的 A（1cm 403nm mg/ml=2.5 ）HRP纯度 （RZ）=A403nm/A275nm纯度 RZ（Ｒ einheit Zahl ）值越大说明酶内所含杂质越少。 高纯 度 HRP的 RZ值在 3.0 左右，最高可达 3.4 。用于 ELISA 检测的 HRP的 RZ值要求在 3.0 以 上。 ELISA 的基本原理有三条： （ 1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面 间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性； （ 2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持 其免疫学和酶学活性； （ 3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay enzyme-linked immunosorbent assay 简称 ELISAenzyme-linked immunosorbent assay 简称 ELISA酶联免疫吸附法)是一种免疫测定技术,ELISA实验的过程是通过包被将抗原（抗体）吸附在固相载体上，加入待测抗体（抗原），再加相应酶标记抗体（抗原），生成抗原（抗体）－待测抗体（抗原）－酶标记抗体的复合物。再与该酶的底物反应生成有色产物，借助酶标仪的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产物成正比。
用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，beta;－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶， 6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶（HRP），碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶催化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。
ELISA的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根颜色深浅计算相应OD值，从而计算相应病毒滴度.
本实验采用双抗体夹心ELISA法：单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的病毒会与单抗结合，游离的成分被洗去。加入生物素化的抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。生物素与亲和素特异性结合；抗体与结合在单抗上的病毒颗粒结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物，若反应孔中有本实验检测的病毒颗粒，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在 450nm 处测 OD 值，病毒浓度与 OD450 值之间呈正比，可通过绘制标准曲线求出标本中病毒的浓度。本实验采用双抗体夹心 ELISA 法。抗人 IL-4 单抗包被于酶标板上，标本和标准 品中的 IL-4 会 与单抗结合，游离的成分被洗去。加入生物素化的抗人 IL-4 抗体 和辣根过氧化物酶标记的亲 和素。生物素与亲和素特异性结合；抗人 IL-4 抗体 与结合在单抗上的人 IL-4 结合而形成免疫 复合物，游离的成分被洗去。加入显 色底物，若反应孔中有 IL-4，辣根过氧化物酶会使无色 的显色剂现蓝色，加终 止液变黄。在 450nm 处测 OD 值，IL-4 浓度与 OD450 值之间呈正比，可 通过 绘制标准曲线求出标本中 IL-4 的浓度。 试剂盒组成： 1．抗体预包被酶标板（8times;12 或 8times;6） 2．冻干标准品（2 / 1 支；0.5ng/支） 3．标准品和标本稀释液（橙盖瓶）（1 瓶；20ml/12ml） 4．浓缩生物素化抗体（紫盖瓶）（1 支） 5．生物素化抗体稀释液（蓝盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml） 6．浓缩酶结合物（棕盖瓶）（1 支） 7．酶结合物稀释液（紫盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml） 8．浓缩洗涤液 20times; （白盖瓶）（1 瓶；50ml/25ml） 9．显色底物（TMB）（棕盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml） 10．反应终止液（红盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml） 11．封板胶纸（6/3 张） 12．产品说明书（1 份） 标本收集: 1. 收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。 2. 血浆抗凝剂推荐使用 EDTA。避免使用溶血，高血脂标本。 3. 标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。 4. 标本收集后若不及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃，-70℃电冰 箱内，避免反复冻融，3-6 月内检测。 5. 如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍 数稀释(建 议做预实验，以确定稀释倍数)。 注意事项: 1. 试剂盒使用前请保存在 2-8℃。复溶后的标准品应分装后，将其放在-20～-70℃ 贮存。 2. 浓缩生物素化抗体，浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置，会使 液体沾到管壁 或瓶盖。因此使用前请用手甩几下或 1000 转/分离心 1 分钟，以 使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前，请用移液器小心吹打 4-5 次使溶 液混匀。 3. 从冰箱中取出的
ELISA(酶联免疫吸附法)的实验步骤：
