- 课题研究背景
生物体中蛋白质多数是由L型氨基酸构成，D-氨基酸仅在在细菌细胞壁的肽聚糖被检测出，因此很长一段时间以来，人们一直认为高等动物中只存在L-氨基酸。直到1981年，从南美树蛙皮肤分泌物中检测出D-氨基酸修饰多肽(DAACP)--皮啡肽,它的镇痛效果高达吗啡的1000倍，而全L型多肽没有生物活性，这一现象不仅导致越来越多的人将目光聚焦在DAACP上，也为DAACP的治疗作用的发现提供了更广阔的前景[1]。
在过去的某个研究中发现，从海兔的亮哥亚种中分离出来一种心脏活性肽NdWFa，显著增强海兔心脏在10-10M处的搏动幅度，但人工合成的L型NdWFa并没有这种效果，表明从L型到D型的修饰对于生理活动的调节也是相当重要的。[2]
虽然生物体内越来越多的DAACP被发现，但是研究显示它们没有对应的密码子，针对1981年发现的皮啡肽进一步研究时发现D-丙氨酸残基是由正常丙氨酸密码子GCG编码的，由此证明氨基酸构型的改变可以通过翻译修饰（PTM）得到。这种翻译后修饰受到自由基、温度、酶和pH等多种因素的影响，从而发生构型的转化，这种转化还会导致蛋白质生物活性和生理功能发生改变，这种改变与白内障、阿尔兹海默症和慢性阻塞性肺病等多种疾病的发生存在着密切的联系。因此，DAACP可以作为一些疾病的生物标志物和药物治疗的靶点进行研究。
二、要解决的问题
在某些情况下，可以基于已知的L/D异构酶特异性，或是来自生物体的已知DAACP的序列，或通过与L/D异构体中已知DAACP的序列相似性来预测进行翻译后L/D异构化的肽。例如，如果在一种生物中发现了DAACP，则可以预测来自同一生物或相关物种的相似肽的序列也可能以DAACP的形式存在。这种同源性指导的发现可以帮助缩小潜在DAACP的范围，随后将对其进行表征。[3]
但是仅靠同源性指导的发现就大大限制了发现新型DAACP的能力。因为激素原的同源性和序列相似性并不总是生物之间DAACP的预测指标。 例如，尽管发现富叶状肽（YAEFL-NH2）是在非洲大蜗牛中的DAACP，但仅以全L型氨基酸的形式检测到了加州西丛鸦中含有相同序列。[4]另外，来自鸭嘴兽毒液的DAACP序列ovCNPb与哺乳动物C型利钠肽（CNP）的序列非常相似。[5]尽管尚未评估哺乳动物CNP可能以多种立体异构体存在的可能性，但不能够仅仅因为这种同源性就假定它们具有D型氨基酸。因此，我们需要研究一种方法实现DAACP快速、简便地鉴别与分离，并且不需要借助生物同源性指导，这也有利于我们发现结构新颖的DAACP。
三、可行性分析
对于DAACP的鉴定，主要是基于DAACP与LACCP的性质（如解离度、溶解度等）的不同而实现，主要包括：质谱，核磁共振和肽消化等。[6]
MS可以对肽（包括大多数PTM和序列）进行结构表征，因此它是肽表征的首选检测器。但蛋白质中氨基酸外消旋化检测的难点主要在于D型氨基酸与L型氨基酸分子量完全一致，蛋白质组学分析中常用的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MADLI-TOF-MS）、液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）等方法都无法对其进行很好的测定。因此，我们通过柱前衍生化的方式使D型氨基酸修饰多肽和L型氨基酸修饰多肽可以更好的分离。
