开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、课题背景
生物正交反应(Bioorthogonal chemistry)自2003年被Bertozzi[1]教授提出以来，一直作为化学生物学领域前沿的研究工具[2]，在新兴的交叉学科研究领域脱颖而出，尤其是应用于生命系统中对活细胞生物分子的标记、追踪和富集等方面的研究[3]。近二十年来，生物正交反应技术随着研究领域的不断扩展也在不断发展革新，至今已有多种类型的生物正交反应被开发和报道[4-5]，例如施陶丁格连接反应(Staudinger ligation)[6]、铜催化叠氮化合物-炔烃环加成反应(Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition, CuAAC)[7]、环张力推动的叠氮化合物-炔烃环加成反应(Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition, SPAAC)[8]和逆电子需求的狄尔斯-阿尔德（Inverse electron Demand Diels-Alder cycloaddition, IEDDA）环加成反应[9]。这些生物相容性极好的生物正交反应不仅能用于完成活细胞层面上生物分子功能的探究，还能将化学反应应用到活动物体内[10]。如生物体内的活体成像[11]，Wang[12]等基于生物正交的点击化学开发了代谢标记和成像策略——将化学标记物（如叠氮基团）提前与靶细胞（如肿瘤细胞）培养后注入生物体内，再引入带生物正交基团（如炔基）的荧光显色剂，二者发生生物正交反应实现共价代谢标记。
不仅生物正交反应的种类在不断被开发，其边界也在不断拓宽。传统的生物正交反应是基于“连接型”的化学反应，而基于化学键“断裂”的生物正交反应，即生物正交断键反应(Bioorthogonal Cleavage Reactions, BCRs)也在近年逐渐兴起[13]。与“连接型”生物正交反应相反，生物正交断键反应受到有机合成化学领域“脱保护”反应的启迪，利用“断键”化学反应实现靶标上感兴趣成分的分离[14]。2014年，Li[15]等开发了“化学脱笼”的生物正交反应，将蛋白质的氨基酸残基（如赖氨酸、酪氨酸等）用“化学笼”保护起来，再在金属钯催化剂的触发下，实现生物正交的“脱笼”反应。2019年，Wang[16]等开发了新型的铜催化的生物正交断键反应，可适用于抗体偶联物中分子连接臂的无痕切割，进一步拓展了生物正交断键反应的适用范围。这些生物相容性好的生物正交断键反应在活体成像[17]、药物开发[18]和临床应用[19]中已有广泛应用。如，Bojtar[17]等提出“条件光笼化”的概念，在特定的生物正交反应中通过化学反应来实现保护与脱保护，并利用光照的时间和空间控制。该团队利用乙烯连接的四嗪香豆素作为“笼”将氨基酸残基保护起来，再加入BCN-OH与四嗪发生生物正交反应，并利用蓝色发光二极管(463nm)照射将氨基酸脱“笼”。该团队通过细胞内荧光成像，将细胞以线粒体靶向化合物预处理后，利用改系统能够实现空间和时间的条件性激活和细胞结构的高度特异性靶向，证明了该概念在活细胞中的适用性。又如Wang[20]等基于在肿瘤上有显著特异摄取的硼氨酸探针，构建了苯丙硼氨酸介导的生物正交剪切系统，赋予硼氨酸探针激活功能，并通过“双靶向激活”策略实现了肿瘤选择性的蛋白调控。该团队将此生物正交剪切系统应用到介导细胞焦亡的Gasdermin蛋白[21]上，实现了肿瘤原位且可控性激活细胞焦亡，并提出了通过引发肿瘤细胞的细胞焦亡可诱导机体高效的抗肿瘤免疫活性进而清除肿瘤。
生物正交断键反应的成功应用不仅证实其在生命活体中具有良好的生物性，也预示着它是化学生物学前沿领域里一种有效且值得开发的工具。生物正交断键反应的关键在于寻找可切割的分子连接臂，其特点是能利用“断键”化学反应实现靶标上感兴趣成分的分离，这也是开发抗体偶联物（如抗体偶联药物[22]、抗体检测试剂[23]等）的核心技术问题之一。因此，基于生物正交断键反应的可切割连接臂，可应用于荧光染色抗体的开发。
- 要解决的问题
1970年，Crick[24]教授首次提出了“DNA→RNA→蛋白质”的中心法则，奠定了分子生物学的根基。其中，蛋白质作为直接执行生命功能的关键实体[25]，测定分析正常和病理状态下的蛋白质水平对理解疾病发生发展的机理及开发有效治疗手段都有着指导性作用[26]。而在单细胞水平对蛋白质的整体分析能促进对细胞层面上功能的理解与探究——原位测定和分析单细胞水平的蛋白质有利于研究异质生物系统（如实体肿瘤、脑组织和发育中的胚胎）的组织、调节和功能[23]。传统的分析蛋白质的方法主要有质谱技术[27]和微阵列[28]技术两种。质谱技术[27]的流程主要是：从细胞裂解液中提取的蛋白质首先用胰蛋白酶消化成肽，并根据肽群的理化性质（如电荷、等电点、疏水性或其组合）进行分馏。然后将这些预分馏的样品通过超高效液相色谱（UHPLC）来实现分离，以进一步降低复杂性，再将从液相色谱中洗脱的肽通过质谱技术进行分析。微阵列技术包括正相蛋白微阵列(Forward Phase Protein microArray, FPPA)和反相蛋白微阵列技术(Reverse Phase Protein microArray, RPPA)[29]。其中，反相蛋白微阵列技术是将组织或细胞裂解液等样本以微阵列的形式打印到固相基底上，然后用特异性抗体检测样本中的蛋白[30]。如2017年，Li[31]等利用反相蛋白微阵列，测量了超过650个独立细胞系中230个关键癌症相关蛋白的表达水平，其中许多细胞系都有公开的基因组学、转录组学和药物筛选数据。该团队报道的数据集概括了突变途径对患者样本中观察到的蛋白质表达的影响，并证明了蛋白质，特别是磷酸化蛋白质提供了预测药物敏感性的信息，而这些信息是相应的mRNA所不能提供的。总之，传统分析技术如质谱和蛋白微阵列技术可用于定性、定量分析蛋白质水平，但其局限在于忽视了蛋白质结构的空间复杂性。而荧光显微镜[32]的应用能定量呈现蛋白质在单细胞中的位置和丰度——利用带有荧光染料的抗体对靶蛋白进行染色，在发射光的照射下可以在荧光显微镜下成像[33]，能实现对蛋白质定性、定量、定位的分析。但荧光成像方法的不足在于常见的有机荧光团和荧光蛋白的光谱会发生重叠[34]，导致其倍增能力具有限制，无法实现多重单细胞蛋白质分析。而基于生物正交断键反应的荧光抗体检测试剂可以解决这样的不足——在由可切割的抗体-荧光基团偶联物与靶蛋白结合后，利用生物正交断键反应将可切割的连接臂切断，洗脱掉前一次的荧光染色，从而可以直接进行再一次的荧光染色。重复“染色”和“洗脱”的过程，可以实现单细胞中多重蛋白质的分析。
本课题拟合成不同的生物正交断键反应的底物，将其作为可切割的连接臂应用于荧光染色抗体中，并比较不同连接臂在抗体上的切割效率。
- 可行性分析
(1)本人经过本科三年的药物化学科研训练，掌握一定的英文文献阅读、有机合成实验操作的技能，愿意专心完成毕业设计实验，态度端正；
(2)指导老师李劼教授在化学生物学、糖生物学、分子生物学、免疫学等方面接受过严格的训练，可以对本课题提供从实验设计到技术支持的全方位指导，保障整体设计方案的顺利实施；
(3)本课题依托南京大学李劼教授课题组进行，课题组已建立起一个完备的集化学生物学、蛋白质科学、肿瘤免疫为一体的研究平台，在技术上、条件上保障本课题中所提出的实验方案的顺利实施。
