PD1单链抗体的筛选及研究文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

PD-1单链抗体的筛选及研究

一、课题背景：

PD-1(Programmed death l)是一个含有免疫受体酪氨酸抑制性基序(ITIM)免疫球蛋白超家族成员，分子量为55KD的I型跨膜蛋白。文献报道PD-1与其配体PD-L1结合后,能抑制活化的T细胞增殖和IL-2和IFN－gamma;的分泌，特别是抑制效应性CD8 T细胞的功能，因此PD-1参与T细胞的负调节。有研究发现，肿瘤微环境可上调肿瘤反应性 T 细胞上 PD-1 的表达，并抑制其分泌效应细胞因子，导致抗肿瘤免疫效应受到抑制，基于此，阻断PD-1/PD-L1成为抗肿瘤免疫干预治疗的新靶点，可有效抑制肿瘤的免疫耐受，促进机体免疫细胞对肿瘤的杀伤。我们的研究思路即制备PD-1，利用PD-1单克隆抗体可有效的阻断PD-1/PD-L1的结合。

我们借助基因工程技术筛选单链抗体，相对全长抗体单链抗体具有以下几个优势：1）相对分子质量小，容易通过血管壁，穿透实体瘤，是导向药物首选的载体；2）免疫原性弱，不易引起超敏反应和排斥反应；3）无Ｆｃ段，不与非靶细胞的Ｆｃ 受体结合，在影像分析中非特异性小，同时在体内清除快，用作造影时对周围组织损伤小；4）易于构建、表达、大批量制备，在疾病研究与治疗中展现了迷人的前景。因此我们的研究思路是通过基因工程技术制备PD-1单链抗体对肿瘤进行诊断和治疗。

目前大量文献普遍采用噬菌体展示技术从抗体库中筛选单链抗体。噬菌体展示技术是将所需多肽／蛋白从大量变异体的集落中提取出来的一种高通量的体外筛选技术，因其高效、实用、便捷的优势现已广泛应用于药物研发的多方面领域。噬菌体展示筛选方法是获取单链抗体的主要方法，将抗体基因克隆引入到噬菌体载体中可建立不同抗原特异性的抗体文库，抗体基因的表达产物融合在噬菌体的外壳蛋白中并展示于噬菌体表面，通过特定抗原对其筛选可得到含有目的抗体基因的克隆，对筛选的克隆进行表达并纯化表达产物即可获得目的抗体。噬菌体展示筛选获得的抗体具有易于筛选、完全人源、可大量制备及易穿透细胞的特性，可作为人体内的靶向载体。

本研究主要是通过对人PD-1胞外区蛋白的表达纯化及利用实验室现有的噬菌体筛选平台进行PD-1单链抗体的筛选，通过获得PD-1单克隆抗体，抑制免疫耐受为抗肿瘤治疗提供有效途径。

1. 实验流程：
2. 人PD1胞外段基因的克隆、蛋白表达

1.1 pET22b（ ）－ PD1 ecr 重组质粒的构建与鉴定

购买PD1 cDNA，设计引物（引入酶切位点，添加His标签），PCR扩增PD1 胞外区基因，双酶切插入到pET22b 原核表达载体中，转化大肠杆菌DH5alpha;，挑取单克隆酶切鉴定、测序鉴定。

1.2人PDL1蛋白胞外区的原核表达及纯化