开题报告内容：
1 题目：人正常肝细胞损伤模型建立及GSH的保护作用
2 研究背景与概况：
肝损伤是临床中极为常见的一种危害人类健康的疾病，因此对各种肝病发生和发展过程中的共同的病理学基础，即肝细胞损伤机制及致病机理的研究以及寻找安全、有效的防治与治疗药物显得尤为重要。建立稳定可靠的肝细胞损伤模型，是相关机制研究、保肝药物活性筛选及药物作用分子机制研究的基础。临床常见肝损伤由于病因不同，常分为病毒性肝损伤、自身免疫性肝损伤、药物性及化学性肝损伤等。而肝细胞损伤是一种由多因素介导的复杂的生物学过程，总的来说分为免疫性和非免疫性肝损伤两大类。
免疫性肝损伤模型，是模拟临床中常见的病毒性肝炎（如乙型、丙型病毒性肝炎）、自身免疫性肝炎及部分药物性肝损伤的模型。该模型在病理生理机制上更接近于人机体内的免疫性肝损伤模型，在针对该类新药的活性评价上有着重要意义，构建体外免疫性肝损伤模型较之动物模型可缩短药物筛周期、降低筛选成本。结合大鼠原代肝细胞培养技术，利用卡介苗致敏和脂多糖离体攻击的免疫手段，可成功构建体外免疫学肝损伤模型，并经联苯双酯、水飞蓟宾等保肝药物进行防护，同法进行动物整体试验，证实了该模型的适用性和可靠性。刀豆蛋白A可以在小鼠体内诱导免疫性肝损伤，其方法为用20 mu;g/mL ConA 预处理肝细胞与20mu;g/mL ConA 预刺激的脾淋巴细胞共同培养，模拟病毒蛋白等诱发的体内免疫反应，建立体外免疫性肝损伤模型。
非免疫性肝损伤主要见于由化学性物质如括酒精、化学毒物和药物等引起的肝损伤。非免疫性肝损伤模型可以模拟临床上肝功能异常，肝功能衰竭等症状。通常是通过引起肝细胞化学损伤的机制有氧自由基、肝细胞内钙超载、脂代谢异常、胆汁淤积及微量元素代谢障碍等机制来构建该模型。常见的非免疫性肝损伤模型包括体外肝细胞氧化损伤模型和体外肝细胞脂代谢异常损伤模型。
体外肝细胞氧化损伤模型是由于疾病、药物或毒物侵入体内后，体内自由基过多或清除过慢，导致氧化应激和抗氧化间平衡打破，自由基则会攻击并损坏大分子，造成细胞膜性结构包括线粒体膜、溶酶体膜等的脂质过氧化物反应，继而膜通透性增加，钙离子超载，细胞器结构破坏、最终导致肝细胞坏死。另外氧自由基对核酸及蛋白质等大分子也可能造成严重损伤，引起DNA 断裂、碱基破坏，可直接作用于蛋白质，或者通过脂质过氧化物间接作用于蛋白质，使蛋白质的多肽链断裂或个别氨基酸发生变化或使蛋白质交联而发生聚合作用，从而使蛋白质的结构发生变化，特别是抗氧化酶，能量代谢相关酶类的活性下降，更易导致细胞功能紊乱。由于Ca2 超载引起的线粒体膜电势丧失，呼吸链功能障碍，电子传递链电子外漏增加，促进了氧自由基的产生，导致线粒体及肝细胞的脂质过氧化损伤。故体内氧自由基的过度激活、脂质过氧化反应的引发和持续是肝细胞损伤重要病理基础之一。利用CCl4和H2O2诱导的大鼠体外原代肝细胞坏死性损伤模型，并通过检测ALT、AST、MDA、GSH-Px 等指标，成功建立大鼠体外肝细胞氧化损伤模型。由CCl4 诱导模型作用更持久，细胞毒性更大，而H2O2诱导模型作用更直接，以短时间急性损伤为主，为进一步开展药物抗氧化保肝作用研究奠定了基础。也可通过影响体外肝细胞氧化系统来建立损伤模型，如TAA可导致SOD活力下降，引起肝细胞抗氧化能力不足，对抗氧自由基引起的脂质过氧化物作用降低，因脂质过氧化可直接影响肝细胞线粒体，导致能量代谢障碍，是线粒体通透性增加，钙离子超载，细胞器结构破坏、最终导致肝细胞坏死。
另一种非免疫性肝损伤模型是体外肝细胞脂代谢异常损伤模型。脂肪性肝病正在严重威胁国人的健康，临床上将脂肪肝大致分为酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝或者二者并存，其中脂肪肝主要为非酒精性脂肪肝。酒精性肝损伤机制相对明确，是由乙醇代谢产物乙醛诱导氧化物酶体增殖物激活受体alpha;（PPAR-alpha;）功能降低，固醇调节元件结合蛋白-1（SREBP-1）表达加强，与脂肪代谢相关的酶合成减少，与脂肪合成相关的酶表达增加，脂肪合成增多，使肝细胞脂肪堆积，另外TNF-alpha;、IL-8等炎症介质和细胞因子对肝脏的损伤可能也是酒精性脂肪肝发生的重要基质之一。脂肪肝模型目前以动物模型多见，一般模型建立需要时间较长，且存在个体差异大、影响因素多，实验条件不易控制、成本较高等不利因素，而建立与人体发病机制类似的、稳定的、可靠的体外脂肪肝细胞模型具有重要的临床与科研价值。利用含0.5%的乙醇和0.01%的FeSO4的RPMI-1640培养液诱导L02人正常肝细胞至第3代，在短时间内成功建立酒精性脂肪肝模型。另用无水乙醇终浓度为60mL/L培养L02细胞株24小时，引起细胞内脂滴形成，并见固醇调节元件结合蛋白-1c（Nsrebp-1c）表达变化，建立酒精性脂肪肝体外模型。目前用于建立非酒精性脂肪肝体外模型细胞株以L-02 和HepG2 两种多见，造模药物多以油酸、或油酸和亚油酸混合物诱导脂肪肝模型、另有C12-C18 长链脂肪酸等造模药物，油酸是引起肝细胞TG累积的最主要脂肪酸，用1.0 mmol/L油酸孵育HepG2细胞24 h可成功建立非酒精性体外肝细胞脂代谢异常损伤模型。
肝损伤是我国常见多发病，目前尚无令人满意的治疗方法。本实验旨在建立体外非免疫性肝细胞损伤模型，以乙醇和CCl4为诱导剂，选择合适的诱导剂量与时间，使得所建立的模型更适于后续机制的研究，更接近临床上的发病机理。比较乙醇和CCl4在诱导肝损伤作用上的区别。并且以GSH为保护剂，验证该模型的可行性。以期为进一步研究药物对体外肝细胞损伤的保护作用奠定基础。
3 研究目的：建立体外肝细胞损伤模型，作为研究各种肝病共同的病理学基础，并验证GSH的肝脏保护作用，以期对临床具有指导意义。
