拟研究或解决的问题
近年来,由抗生素滥用造成的细菌耐药性的增强以及耐药菌种的增多是全世界面临的严问题,因此,寻找结构新颖且具有强抗耐药性的新型抗菌药物一直是新药研究中的热点,然而,受到新药发现过程的偶然性和筛选技术的局限性影响,新型新抗菌药物的发现一直都是新药研究中的难点。另外一方面,现今发现的数万种抗生素中,仅有极少数投入临床使用,绝大部分抗生素因为各种原因而被束之高阁。如何能更加有效地利用现有的抗菌药物资源,让更多的药物从研究走向应用,并同时加快新抗菌药物的发现,是摆在所有科研人员面前的难题。为了解决这些难题,我们势必要进一步加深对抗生素合成过程的了解。
诺西肽是一种具有强力体外抑菌作用的硫肽类抗生素,对革兰氏阳性菌、尤其是部分耐药菌都具有强杀伤作用,但是其低产、低水溶性、低生物利用度等缺点大大抑制了其广泛应用。与多数已发现的硫肽类抗生素相同,诺西肽的生物合成也属于翻译后修饰机制,但具体的生物合成途径仍然未被完全阐释。近年来,抗生素生物合成的调控机制越来越受到重视。对 S.actuosus ATCC 25421 中 NOS 基因簇的分析发现一个与诺西肽代谢调控相关的基 因 nosP, BLAST结果揭示该基因表达的蛋白属于SARP 家族,可能和非编码区内的基因元件结合,影响诺西肽的合成,但相关研究至今仍为空白。另外,生物信息学分析结果推测诺西肽前导肽基因 nosM 和nosL之间段长 351nt 的非编码片段(non-coding region, NCR)可能存在 nosP 的靶标启动子。基于以上信息,本课题组将进一步完善 S.actuosus 中的遗传操作方法,通过基因缺失、互补、过表达、RT-qPCR 等手段探索 nosP 对诺西肽生物合成的影响,同时构建报告质粒和宿主系统钓取 NCRL-M 中的转录调控元件,并进一步研究 nosP 和转录元件之间可能存在的相互作用,进而阐明诺西肽生物合成途径中转录水平的调控机制。
课题目标:(1)确定 nosP 在诺西肽生物合成中发挥的作用;(2)建立和完善诺西肽产生菌 S. actuosus ATCC 25421 中启动子钓取和报告系统,完成对 NCRL-M 的结构和功能分析;(3)实现调控蛋白 nosP 的异源表达,建立并优化其纯化方法;(4)阐释 NosP 对诺西肽生物合成 调控作用的分子机制。
预期研究结果和意义:本实验将建立和完善诺西肽产生菌中启动子钓取和报告遗传操作体系,并阐释 nosP对诺西肽生物合成次级代谢的调控机制,为诺西肽产生菌的定向遗传改造、诺西肽高产株的构建和筛选提供理论和实践基础,同时为深入理解翻译后修饰天然产物的代谢调控途径和机制提供新方法和新思路。
采用的研究手段
利用同源重组的方法在野生型诺西肽产生菌S. actuosus ATCC25421的基础上构建nosP 缺失突变株、回补突变株和过表达突变株,同步培养发酵,通过HPLC-UV 检测不同突变株发酵液中产物组成的变化和诺西肽产量的变化,确定NosP 在诺西肽生物合成中发挥的功能;(2)构建nosP 的异源表达载体,在大肠杆菌中过表达NosP蛋白,建立纯化方法,为在体外研究其功能奠定基础;(3)构建适用于S. actuosus中启动子分析的宿主——载体系统,并以该方法研究非编码序列NCRL-M 的功能。
文献综述
诺西肽是一种典型的硫肽类抗生素,对革兰氏阳性菌具有强效的抑制作用。活跃链霉菌是诺西肽的工业生产菌种,其诺西肽生物合成基因簇(nos)已被成功钓取并测定。过去的30余年间,科学家致力于解析该基因簇控制的诺西肽生物合成途径,与此相对,相关的基因调控则鲜有问津。对 nos 基因簇的生物信息学分析显示,nosP 基因的编码蛋白与链霉菌激活调控蛋白家(SARP)高度同源。对生型活跃链霉菌中 nosP 基因的敲除后,获得的nosP 缺失突变株完全丧失了合成诺西肽的能力。对 nosP 缺失突变株进行 nosP 互补后,互补突变株新获得了诺西肽合成能力,但其诺西肽产仅能达到较生型菌株的一半左右。在生型活跃链霉菌中过表达 NosP 后,突变株的诺西肽产提高了一倍以上。以上实验结果共同证明了 NosP 是诺西肽生物合成所必须的一个阳性调节因子。RT-qPCR的结果,结合 nos 基因簇的进一步分析,我们推测在一对反向排列基因 nosL和nosM 之间的非编码区(NCRL-M)内可能存在NosP的靶标位点。为了进一步研究nos 基因簇中基因转录水平的调控,我们构建了一个载体——宿主系统。该系统由一个大肠杆菌——链霉菌穿梭质粒pWHM7 和一个 nosA 缺失突变体 L1101 组成。pWHM7 上双拷贝转录终止子下游含有的polylinker 可供报告基因(即启动子缺失的 nosA 基因)插入,从而构成启动子捕获载体。nosA基因上游可根据需要引入片段,若该片段具有启动子活性,则可激活 nosA 基因转录,从而催化L1101内带有丝氨酸尾巴的诺西肽前体(NOS-V)转化为诺西肽(NOS)。通过检测NOS的发酵产,分析其转化程度即可判断引入片段的启动子活性。在本研究中,我们用该系统对 NCRL-M 进行了启动子钓取和分析。结果显示,在 L1101 中,NCRL-M 在两个方向都存在强启动子活性。我们还运用 5rsquo;RACE 技术成功定位了 nosL 和 nosM 基因 mRNA 的转录起始位点。
2009年,中科院上海有机所的刘文教授课题组成功钓取并测定了活跃链霉菌(Streptomyces actuosus ATCC 25421)中约 35kb 的诺西肽生物合成基因簇序列(如图 1-8)。对该基因簇中的各个基因的生物信息学分析显示,nos基因簇包括16个基因:7个与诺西肽大环骨架生物合成相关,5个和侧链生物合成相关,4个与翻译后修饰相关,1个与代谢调控相关。
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