课题背景：
肝素黄杆菌是目前发现能够利用肝素作为C源的革兰氏阴性菌，它利用体内表达的3种不同的肝素酶（包括肝素酶I、II、III）以及其他4种不同的酶将长链肝素降解为简单的葡萄糖胺，作为菌体生长的基本C源供自身利用。[5]这三种不同的肝素酶在裂解肝素过程中均采取内切的方式降解肝素。由于缺乏有效的基因编辑手段，肝素黄杆菌的遗传操作到目前为止仍旧非常困难，严重制约了其作为新一代工程菌的探索[2]。
CRISPR/Cas9作为新兴的第三代基因编辑工具，利用成熟的crRNA与tracrRNA通过碱基互补配对形成双链RNA复合物并引导Cas9蛋白对特定的DNA序列进行切割，以其设计简单、耗时短、效率高等优点使其成为一项具有广阔应用价值的基因靶向敲除技术。研究发现CRISPR/Cas 系统普遍存在于细菌以及古细菌当中，是长期进化形成的一种获得性免疫机制，能够抵抗外来遗传物质进入。[4]CRISPR是一种规律成簇间隔短回文重复序列， Cas蛋白基因位于CRISPR位点下游，不同CRISPR 系统中的Cas蛋白种类不同。[3]CRISPR系统目前主要分为3种类型：I、II、III型。其中I 型系统中的Cas蛋白最多且作为复杂。其主要组成蛋白为Cas3，该酶具有核酸酶和解螺旋酶的功能[10]。III型系统主要分布于古细菌中，在细菌中比较少见，该系统的核心蛋白为Cas10，主要参与crRNA 的成熟和外源核酸的降解[11]。本实验中运用的II型系统主要分布于细菌当中，该系统结构简单,其核心蛋白为Cas9, Cas9蛋白具有2个重要的核酶功能的结构域:RuvC 和 HNH，RuvC具有切割目标序列的互补链，而HNH 结构域切割目标序列的非互补序列[7]。它可以与成熟的crRNA形成复合物降解入侵的噬菌体DNA或外源质粒[1]。Cas9对外源DNA强烈的切割能力需要crRNA和tracrRNA的介导。成熟的crRNA与tracrRNA配对形成双链RNA，在tracrRNA的引导下，该蛋白复合物对外源基因序列进行扫描，定位入侵序列PAM区并对相应的与间隔序列同源的外源片段进行降解。[8]为操作方便，将crRNA和tracrRNA融合成一条嵌合的RNA链使其同时具有crRNA和tracrRNA的特性，称为sgRNA，它同样具有引导Cas9切割目标DNA的功能。在构建重组质粒的过程中，将Cas9和sgRNA连接在同一载体上并以双启动子启动，即可实现Cas9和sgRNA的共表达，对目标DNA进行切除[9]。
本实验通过在肝素黄杆菌中导入Cas9蛋白和sgRNA融合表达的载体，通过设计不同的sgRNA来对肝素黄杆菌中的肝素酶I、II、III进行特异性敲除，建立肝素黄杆菌的遗传操作系统。
实验目的：
通过利用II型CRISPR/Cas系统的敲除和插入功能，在广谱性质粒pBBR1载体上构建Cas9和sgRNA 融合表达的表达型载体，改变sgRNA上gRNA的20个核苷酸序列，从而特异性的敲除靶标序列（肝素酶I、II、III），并通过深度测序和体内肝素酶活性检测进一步验证敲除位点以及敲除效率，从而建立基于CRISPR/Cas9 系统的肝素黄杆菌的遗传操作系统，为后续探究肝素黄杆菌功能改造做铺垫[6]。
研究方法：
1、肝素黄杆菌的复制型载体的筛选
结合肝素酶I的启动子序列hepA与甲氧苄啶抗性基因(tmp)，构建报告基因Htmp，通过分子克隆的方法插入到待筛选质粒中（pBBR1载体），通过三种不同的转化方法，将带有报告基因的载体导入到肝素黄杆菌中，利用甲氧苄啶抗性筛选能够在肝素黄杆菌体内稳定存在的复制性质粒。
质粒转化的三种途径：
