一．选题依据
在生物体中蛋白质磷酸化修饰是最常见,最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式,蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的所有关键过程。但一个细胞中的蛋白质可多达上万种,而它们的动态范围又很宽(血浆中所含蛋白质浓度的动态范围达到1012数量级),即使采用目前最先进的技术,在不经预分离的情况下也无法有效地进行低丰度蛋白质的鉴定分析。磷酸化蛋白质在生物体内表达的含量很低,同时发生磷酸化的部分在其蛋白质总量中的比例不到10%,酶切后磷酸化肤段会被大量的非磷酸化肤段所掩盖,而且磷酸化肽段本身所具有的负电性又使其在常用的质谱分析的正离子模式下产生很弱的响应信号;其次同一个蛋白质中可能存在不同类型,不同位点的磷酸化形式,这些修饰中的其中一些是化学不稳定的,在蛋白质分离过程中易降解;再次磷酸键较肽键容易断裂等特点,从而使得磷酸化蛋白质的分析比非磷酸化蛋白鉴定困难得多。
同时又因为人体内蛋白质磷酸化的失调会导致很多严重的人类疾病,如癌症,糖尿病,心脏病,老年痴呆症等。因此,蛋白质磷酸化研究是蛋白质组学研究的热点,同时用蛋白质组学的策略研究生物体的磷酸化修饰也是功能蛋白质组学的重要研究内容。因此，磷酸化肽段的富集方法的研究是十分重要的。
而20 世纪 80 年代纳米技术的出现引起了世界科学家的广泛关注,日渐成为当今世界材料科学研究的热点。原子簇和宏观物体交界区域的尺寸在l~100nm 之间的纳米材料,既非典型的微观系统,亦非典型的宏观系统,属于一种介观系统,具有一些小尺寸效应和表面效应等独特的性质,使其在热学、电学、磁学等方面呈现常规材料不具备的特性。磁性 Fe3O4纳米粒子是具有特殊结构和磁性能的一种新材料,广泛应用于医学、环保、电子信息、生物等领域。尤其在生物医学材料及磁性材料方面展示了巨大的应用前景，其中一个应用就是用来富集生物体内的磷酸化肽段。
目前对磷酸化蛋白质的富集方法主要有两类。一种是基于蛋白水平的富集方法，包括抗体富集法、激酶特异富集法；一种是基于肽段水平的富集方法，包括固相金属离子亲和色谱(IMAC) 、金属氧化物/氢氧化物亲和色谱(MOAC) 、阳离子交换色谱富集法、阴离子交换色谱富集法等。其中最常用的两种方法是：固相金属离子亲和色谱(IMAC)和金属氧化物/氢氧化物亲和色谱（MOAC）。
IMAC最早由Porath于1975年提出,经过几十年的发展,已经成为目前最为普及的磷酸化肤段分析方法。IMAC方法富集磷酸肽的原理是:带正电的金属离子,如Fe3 、Ga3 、Cu2 可以与带负电的磷酸基团通过静电相互作用而结合,这种结合能力受到pH值、离子强度和溶液有机相的影响。在高pH值或磷酸盐存在的缓冲液中,金属离子与磷酸基团间的相互作用被破坏,磷酸化肽被释放出来。其优点是直接,快速等,且富集后的样品经过脱盐处理后可以直接用于质谱分析。但IMAC技术也有其局限性,如可能会丢失一些低丰度的、没有结合到IMAC柱上的磷酸化肽段；具有多磷酸化位点的肽由于其较强的亲和力较难被洗脱下来；某些酸性基团(如天冬氨酸和谷氨酸)、电子供体(如组氨酸)也会结合到柱上,造成非磷酸化肽的污染。所以,用IMAC方法富集磷酸化肤的效果如何,在很大程度上依赖于所选择的金属离子、填充柱的材料及洗脱程序。
金属氧化物/氢氧化物亲和色谱(MOAC)是近几年得到发展的磷酸肽富集技术。目前,研究主要集中在TiO2富集磷酸肽上,对ZrO2和Al(OH)3等富集磷酸肽的研究也在同时开展。TiO2富集磷酸肤的原理并不十分清楚。根据已有研究结果,TiO2是一种两性物质,由于钛原子和氧原子的原子表面化合价不饱和,TiO2在不同的pH值下可以表现为路易斯酸或路易斯碱。在酸性溶液中,钛原子带正电表现为路易斯酸,可以与阴离子结合。有实验表明,磷酸盐、硼酸盐、羧酸盐和硫酸盐都与Ti02具有高度的亲和力,其中TiO2与磷酸盐的结合能力最高。所以在调节pH值后,Ti02可以用于富集磷酸肽。经查阅文献资料获知Koshi等利用TiO2富集方法和nano LC一MS/MS在线连用对Hel巨细胞系进行磷酸化蛋白质组学研究,鉴定到512磷酸化蛋白上的671个磷酸化位点,并且首次建立了TiO2在线富集鉴定复杂样品的磷酸化分析体系。虽然该技术在对磷酸化肽段富集时的选择性和灵敏度方面都优于IMAC技术,但也存在分离富集效率和非特异性吸附等问题。
而此次课题研究我们拟构建一种新型的IMAC和MOAC杂合材料，即将Ti4 和TiO2键合在同一基质上，可一次性实现IMAC和MOAC两个方法的串联这样极大的减少了样品的损失，同时提高了磷酸肽富集量，为磷酸化肽段富集提供了一种新策略。
二．本实验拟解决的问题
1、合成Fe3O4磁球
