开题报告

——囊泡转运相关蛋白YIPF6抵抗肥胖的分子机制研究．

文献综述

超重与肥胖在世界范围内以流行病的态势蔓延，对人类的健康构成了严重的挑战[1-3]。据WHO统计显示，2016年全世界成年人中有约39.1%超重，其中肥胖的比例占到了三分之一。而在我国，超重的成人数量已超过三分之一，肥胖的比例也在逐年上升。《柳叶刀》曾有调查显示肥胖与全因死亡率呈正相关关系[4]，也有研究表明，肥胖增加了胰岛素抵抗、血脂紊乱、高血压发生，提高心血管事件、Ⅱ型糖尿病、代谢综合症的发生频率，使癌症与心脑血管疾病的风险大大增加[4-7]，从而影响人类的健康与社会的安定以及经济的繁荣。所以肥胖已成为当代社会必须要认真面对的一个问题。

现有的抗肥胖策略及其概况

对于肥胖，现有的应对策略包括调整生活习惯、手术与药物治疗。目前已投入临床的药物的作用机制多为激活中枢儿茶酚胺能神经系统抑制食欲并增加能耗或抑制脂肪酶活性从而减少脂肪吸收，其中可用于短期降体重治疗三种安非他命样拟交感神经药物，但具有成瘾性且可能诱发肺动脉高压；可长期服用的药物如奥利司他、西布曲明、利莫那班等由于治疗效果不明显或严重的不良反应而被限制了临床应用[8-12]。而新型药物的研发同样面对着类似的问题而陷入了瓶颈。因此，寻找并鉴定抵抗肥胖的新型靶点，并针对性地研发潜在治疗药物成为当务之急。

FGF21对肥胖的抵抗机制

成纤维细胞生长因子21（FGF21）是一类具有多向性作用的类激素样蛋白质，在体内由PPARalpha;诱导产生，刺激白色脂肪组织的脂肪分解与生酮作用[13]。外源性FGF21小鼠肥胖模型摄入后减少了总体脂，产生强大的抗肥胖作用[14]。在肥胖状态下，FGF21主要由肝实质细胞分泌，随后进入血液循环通过与其受体beta;Klotho/FGFR1c结合而作用于靶组织，包括肝脏本身、白色及褐色脂肪组织、胰腺及大脑等[13, 14]。研究显示重组的FGF21蛋白能够在高脂食物诱导的肥胖小鼠、胰岛素抵抗的ob/ob和db/db 小鼠以及Zucker糖尿病大鼠等模型中体现较明显的降低脂肪生成和体重、降低血糖、血浆甘油三酯及胆固醇含量、逆转脂肪肝、增强胰岛素敏感性、增加能量消耗等众多抗肥胖和胰岛素抵抗效果[13, 15-20]。FGF21的上述特性已经引起了科研工作者探索其作为抗肥胖及II型糖尿病新型药物的强烈兴趣[12]。但是，重组的FGF21蛋白在血浆中的半衰期比较短，约为0.5-5小时，这极大地限制了其在治疗中的应用[14,15,17]。因此改善其生物物理特性，开发增强其在血浆中稳定性的FGF21类似物是围绕FGF21所研发的抗肥胖策略之一，比如Lilly 公司研发的FGF21类似物LY2405319, 在肥胖及相关II型糖尿病病人中均体现了非常明显的抗肥胖及改善血脂的疗效[21]。另外，Wu等人围绕FGF21的受体FGFR1所研发的受体激动剂能够在肥胖及II型糖尿病小鼠中显著地降低血糖、血脂水平及脂肪肝的程度[22]。这些结果都显示了围绕FGF21所研发的抗肥胖药物的应用前景。FGF21具有N端信号肽，在内质网上被包装进COPII囊泡出芽并转运然后分泌到胞外以内分泌激素的方式执行功能。在肥胖状态下提高FGF21的内源性分泌将能够有效而稳定地提高血液中FGF21的浓度，而且也能避开研发重组的FGF21蛋白类似物所碰到的种种问题。但目前关于FGF21在细胞内分泌的调控研究非常有限，寻找和鉴定能够调控FGF21分泌的关键蛋白分子，或可成为一种全新的抗肥胖治疗策略。

囊泡转运相关蛋白YIPF6

囊泡转运相关蛋白YIPF6属于YIPF家族，该家族包括YIPF1-7七个成员[23,24]。在哺乳动物细胞中，YIPF家族的功能研究非常有限。但研究显示其在酵母中的同源蛋白YIP家族成员（主要包括YIP1、YIP4以及YIP5）主要作为膜受体与YPT家族成员(哺乳动物细胞中同源蛋白为Rab家族成员)相互作用而参与了COPII囊泡在内质网的出芽、转运、囊泡与高尔基体膜的融合等过程[25-29]。Yipf6基因位于X染色体上，根据同源蛋白结构分析进行推测，YIPF6蛋白具有5次跨膜结构，其N-terminal指向细胞浆，C-terminal指向膜腔，它与COPII囊泡标志性蛋白SEC31a以及cis-Golgi 标志性蛋白GM130具有共定位， 提示YIPF6参与调控COPII囊泡转运的可能[23,24]。另外，研究显示YIPF6在分泌旺盛的细胞中表达水平显著上升（高于一般表达水平的30-50倍），提示了YIPF6在囊泡转运中非常重要的调控作用[23]。为了研究YIPF6对FGF21分泌的潜在调控，我们选取了Klein-Zschocher (KLZ)小鼠作为体内研究的小鼠模型。 KLZ小鼠来源于2011年生理或医学诺贝尔奖得主Bruce Beutler实验室[23,24]。如下图所示[24]，该小鼠Yipf6基因上携带一个由化学物质N-ethyl-N-nitrosourea (ENU)所引起的T到A的点突变。该位点的突变引入了一个终止密码子TAG，使得蛋白在翻译到89位氨基酸时提前终止（YIPF6全长由236个氨基酸组成）。 尽管KLZ小鼠中可能含有截断的YIPF6片段（1-89aa），但来自该实验室进一步的研究显示KLZ小鼠在功能上等同于Yipf6敲除小鼠（whole-body knockout）[24]。

因此KLZ小鼠提供了体内研究 YIPF6对FGF21分泌调控的便利，我们将以动物水平发现的现象为起点，进行细胞水平的验证和分子水平的机理探索。

研究内容

细胞及分子水平研究YIPF6对 FGF21分泌的影响及其分子机制

考虑到肥胖状态下血清中的FGF21主要是由肝脏的肝实质细胞分泌，将分离高脂食物喂养的野生型及KLZ小鼠的原代肝实质细胞，在原代细胞水平比较FGF21分泌的差异，并利用激光共聚焦显微镜观察载有FGF21的COPII囊泡在数量及分布方面的差异。另外，将选取正常小鼠肝细胞系AML12细胞，在该细胞中利用慢病毒系统过表达和敲除YIPF6，检测FGF21分泌的变化，并在该细胞中应用激光共聚焦显微镜技术研究载有FGF21的COPII囊泡数量及分布的变化，最后利用免疫共沉淀（Co-IP）、表面等离子共振（SPR）等技术鉴定与YIPF6相互作用的引起COPII囊泡发生变化的具体蛋白，即找到YIPF6影响FGF21分泌的详细的分子机制。在此方面，我们将以YIPF6在酵母中的同源蛋白Yip1p的功能为参考，将集中研究YIPF6对COPII囊泡出芽、转运及与受体膜融合的影响以及与参与这些过程的重要蛋白的相互作用。拟考察的蛋白主要包括：SEC12，SEC16, SEC24, RAB1, SEC31以及SAR1，将系统研究YIPF6与以上蛋白的相互作用。

研究手段

① 原代肝细胞的分离

② 采用慢病毒系统在AML12细胞中稳定地过表达及沉默YIPF6