一、实验背景
血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor ,VEGF) 最早在1983年由Senger [1]等发现， 由两条8 个外显子和7 个内含子组成的23 kD 的单链蛋白构成[2]，是一种主要在婴儿时分泌以促进血管形成和生长的因子[3,4],正常的成年人只在受伤等病理情况下分泌VEGF。而各种癌细胞均分泌VEGF 和可促进VEGF表达的其他蛋白因子。
实验发现VEGF在大多数动物和人的肿瘤细胞中高表达，多集中在肿瘤血管周围[5]。肿瘤组织的生长需要新血管的生成来提供足够的氧气和其他营养物质，VEGF是一种与血管生长有关的特异性的细胞因子，并且是目前被认为特异性最强直接作用于血管内皮细胞的生长因子[6]。VEGF可与内皮细胞表面特异受体结合,能促进血管内皮细胞的增殖从而使得血管肿瘤产生大量结构和功能异常的血管并通透性增加[7,8]， 促进肿瘤的生长，故肿瘤生长的恶性循环由此产生。肿瘤组织的VEGF表达显著增加，同时表达增加的VEGF又将促进肿瘤细胞的增殖与转移，故VEGF的抗体具有能抑制肿瘤生长的作用[9]。研究表明， VEGF及其受体在癌症的淋巴结转移和淋巴管形成方面也发挥积极的作用[10]。其机制可能是因VEGF高表达促使血管基底膜水解，癌细胞从血管通透性增高[11]的毛细血管游出进入淋巴管，导致淋巴转移。
VEGF 已知有 4 种二聚体类型( VEGF121,VEGF165,VEGF189 和 VEGF206) ， 都由同一基因的不同 ＲNA 剪切而成， VEGF121 和 VEGF165 分子量小， 为分泌型， 而 VEGF189和 VEGF206 分子量较大， 为细胞型。发现大量研究证实, 血管内皮生长因子165( vascular endothelial growth factor 165 , VEGF165),能加速血管内皮细胞(vascular endothelial cell ,VEC) 损伤的修复, 使血管内血栓形成及血栓性闭塞减少, 并抑制内膜增生。VEGF165是机体内含量最高，生物活性最大的促血管生长引子[12]，作为一种高特异性的促血管生长因子[13]，VEGF已被用于冠心病防治的研究,研究发现VEGF能够促进缺血心肌小血管增生,恢复缺血的心肌血流供应,减少梗塞面积。另有文献报道,VEGF 能促进缺血肢体动物模型侧枝循环的建立、改善缺血肢体血液灌注的功能。
人源VEGF 的原核表达研究早有报道,但由于原核细胞不具备蛋白糖基化功能,且表达产物多为包涵体,复性困难，会影响到人源VEGF的生物活性和免疫原性。因此,对人源VEGF 的真核表达产物的研究受到了人们的重视[14]。生物技术蛋白类药物 （如抗体、 疫苗、 细胞因子,酶等） 多数为糖蛋白。蛋白的糖基化形式分为N-糖基化和O-糖基化两种， 其中N-糖基化尤其重要， 因为与蛋白的折叠、 体内半衰期、 稳定性及蛋白功能密切相关[15]。迄今， 上市的人源化治疗抗体中95%均为哺乳动物表达系统的产物。然而， 由于哺乳动物细胞固有的生长缓慢、 环境和营养要求高等特点， 决定了哺乳动物细胞系统依然是高成本的基因工程蛋
白生产系统。因此， 抗体药物的发展迫切需要一种高效、 廉价的新型蛋白表达系统。故此次实验使用酵母菌[16]作为宿主细胞进行人源VEGF的发酵制备。使用的Pichia酵母是一种嗜甲醇酵母,可通过甲醇诱导重组蛋白的表达。该表达系统因其表达量高、可操作性强以及对产物的真核系统后加工能力而深受研究者的青睐。本研究即利用Pichia 酵母真核表达系统( GS115宿主细胞) 分泌表达重组人VEGF1 65蛋白,为开发VEGF 及VEGF抗体创造条件。
参考文献
[1] Senger DR，Perruzzi CA，Feder J． A highly conserved vascular permeability factor secreted by a variety of human and rodent tumor cell lines ［J］． Cancer Ｒes，1986，46 ( 11 ) : 5629－ 5632．
[2]向本旭,刘婷婷,孙芳玲,艾厚喜,王文.VEGF相关信号通路在血管新生中的研究进展[J].中国比较医学杂志,2015,25(12):81-86.
[3]Asano M, Yukita A,Matsumo to T, et al.Inhibition of tumor growth and metastasis by an immunoneutralizing monoclonal antibody to human vascular endothelial growth factor / vascular permeability factor 121[ J ] .Cancer Res , 1995, 55: 5296 -5302.
