T蛋白调控血管新生的功能研究开题报告
研究背景
双层核膜结构是真核生物区别于原核生物的重要特征，内核膜蛋白是位于细胞核内层核膜上的跨膜整合蛋白。内核膜蛋白以及内核膜蛋白与核纤层蛋白之间的相互作用对于维持细胞的正常结构和功能意义重大，核膜蛋白缺失或突变与人类疾病密切相关，如核纤层蛋白综合征，各类癌症以及免疫缺陷病毒感染等。T蛋白是近几年新发现的内核膜的蛋白，关于其结构和功能目前还没有任何专门报道。血管网络是遍布全身各处的重要结构，也是胚胎时期最早开始发育的器官。血管的生成包括血管生成（vasculogenesis）和血管新生（angiogenesis）。血管新生既参与正常的生理发育，也在多种病理进程中有重要作用。血管新生的重要过程包括：血管舒张、内皮通透性和内皮外细胞支持→顶端细胞选择与出芽→管腔形成→内皮细胞分化与成熟。在这些过程中，血管内皮细胞的迁移发挥着重要作用。近年来血管新生领域较为停滞，缺少创新的研究，这给我们研究T蛋白在血管新生中的功能带来契机和希望。前期研究中发现在血管内皮细胞上敲低T蛋白，内皮细胞的运动、迁移、管腔形成能力减弱。因此提出了科学问题：T蛋白是否在调控血管新生中发挥一定作用。本课题中将利用T敲除小鼠，进行血管新生功能考察与评价，在动物水平上完成T调控血管新生的功能研究，并初步探索机制。
研究内容
核膜具有典型的双层膜结构，包括内核膜，外核膜，核孔复合物等。核膜蛋白因所在位置不同被分为内核膜蛋白，外核膜蛋白，核孔复合物蛋白以及核纤层蛋白，每类核膜蛋白除分布位置不同外其生物学功能也不同。人源T基因是位于1号染色体上的基因，其转录的RNA经剪切有5个转录本，其中3个有编码蛋白质，被CCDS（Consensus Coding Sequence）收录并进行基因注释的是S蛋白与T蛋白。T蛋白为一种长度为666aa的5次跨膜结构的内核膜蛋白，S蛋白为其亚型，为4次跨膜结构，相比于T蛋白S蛋白缺少396aa-666aa区段，且C端382aa-392aa也不同于T蛋白。
T蛋白是一个新发现的内核膜蛋白，其结构与功能鲜有文献报道，但S蛋白作为亚型其结构与功能的研究已取得了一些进展，有文献报道S蛋白可通过与其他核膜蛋白相互作用的方式参与调控细胞迁移，考虑到T蛋白与S蛋白N端的相似性，T蛋白也有可能存在相似的功能。前期研究中发现在血管内皮细胞上敲低T蛋白，内皮细胞的运动、迁移、管腔形成能力减弱，而血管内皮细胞的迁移与多种生理病理过程相关，因此本课题将在前期细胞实验的基础上在动物水平研究T蛋白调控血管新生的作用。
本课题计划进行体外与体内实验。体外实验包括构建T蛋白敲低的稳转株，以及利用该稳转株进行transwell实验。首先选择载体质粒进行酶切，利用PCR技术扩增目的片段，DNA电泳检测酶切结果与PCR结果，之后将目的片段与载体连接，转化入感受态细胞，挑取克隆送基因测序确认后扩增阳性克隆并抽提质粒。获得质粒后通过慢病毒包装体系感染宿主细胞，通过相应抗生素进行筛选，最终获得稳转株。获得稳转株后传代培养，待其稳定后进行transwell实验，将一定数量的稳转细胞与未处理细胞接种于transwell小室，小室内为不含FBS的培养基，小室外为含FBS培养基，小室内外通过具有一定孔径大小的滤膜连接，一定时间后固定，染色并观察滤膜背面细胞数量，通过与未处理细胞的对比来判断其迁移能力的变化。
体内实验通过新生鼠视网膜血管新生实验以及构建小鼠后肢缺血的模型来考察T蛋白敲低小鼠的血管新生功能。新生鼠视网膜血管新生实验是一个研究血管新生的较好的模型，因为小鼠视网膜内的血管丛不论动脉静脉还是毛细血管均为出生后一周才发育形成，是一个天然的血管新生模型。在此实验中处死小鼠摘取眼球，分离视网膜，使之通透，孵育抗体，裁切后封片成像，观察血管新生状况。小鼠后肢缺血模型中，首先麻醉小鼠，分离并结扎股动脉，缝合伤口，激光多普勒成像观察灌注情况，处死小鼠，取其后肢腓肠肌做组织切片，使用抗CD-31抗体免疫荧光染色血管，通过与未手术的一侧对比，可观察其侧支动脉血管新生情况，从而判断其血管新生能力的变化。
预期成果
通过transwell实验，新生鼠视网膜血管新生实验以及构建小鼠后肢缺血模型证明T蛋白对血管内皮细胞的运动、迁移、管腔形成能力的影响。
进度安排
2019年2月25日-2019年3月10日 文献阅读以及实验方法学习
