开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、研究背景及立题依据
黑色素瘤是一种来源于黑色素细胞的恶性肿瘤，恶性程度高，预后差。每年全世界被确诊为黑色素瘤的新增患者数目高达80000 例[1]。黑色素瘤的发病率正以每年4.1%的速度显著上升，快于任何其他恶性肿瘤[2]。除传统的手术切除及放疗外，黑色素瘤的临床治疗手段主要有免疫疗法、靶向治疗及化疗[3-5]。其中化疗由于副作用大且效果不如免疫疗法及靶向治疗[6]，已逐渐退出黑色素瘤临床治疗的一线舞台。
目前，在黑色素瘤临床治疗中常采用免疫疗法与靶向疗法进行联合治疗[7]。在免疫疗法中应用最广泛的是免疫检查点抑制剂，其中最经典的是PD-1/PD-L1抑制剂。程序性死亡受体（programmed death-1，PD-1）是激活型T细胞的一种表面受体[8]。肿瘤微环境会诱导浸润性T细胞高表达PD-1分子，而肿瘤细胞则高表达PD-1的配体PD-L1，PD-L1与PD-1结合后，T细胞功能被抑制，不能有效识别并杀伤肿瘤细胞。而PD-1/PD-L1抑制剂可以阻断PD-1与PD-L1的结合，阻断负向调控信号，使肿瘤浸润性T细胞恢复活性增强免疫应答[9]。此外，靶向疗法主要是通过MAPK信号通路抑制剂来抑制黑色素瘤的生长。MAPK 信号通路能够促进细胞增殖、存活、浸润以及肿瘤血管生长，是黑色素瘤转移的重要分子机制之一[10]。MAPK 通路的调节异常在包括黑色素瘤的多种类型的肿瘤中普遍存在。BRAF和RAS基因突变是目前观察到的MAPK 级联反应中的重要一环，其突变会导致MAPK通路的持续性激活从而促进肿瘤的增殖和转移[11]。MAPK信号通路抑制剂主要有BRAF抑制剂和MEK抑制剂，研究表明MEK抑制剂对T细胞具有毒性，因此拟选择BRAF抑制剂进行后续的研究。但此种联合治疗策略需多次给药，患者顺应性差，且药物在肿瘤微环境及肿瘤细胞中难以达到治疗用的药物浓度，易产生全身毒性。
因此，为了改善联合治疗策略的患者顺应性，增加药物的靶向性同时降低全身毒性，本课题拟设计多层次响应型纳米递药系统，分别在肿瘤微环境以及肿瘤细胞内释放相应的药物，增强黑色素瘤治疗效果。
首先拟构建荷载BRAF抑制剂的谷胱甘肽（GSH）响应的脂质体作为多层次响应型纳米递药系统的内核，该脂质体内核由大豆磷脂（S100）、胆固醇（Chol）、还原敏感脂质材料（SS-Lip）及BRAF抑制剂PLX-4032组成。研究表明，肿瘤细胞内的还原物质GSH（2-10 mmol/L）浓度是细胞外GSH 浓度（2-20 mu;mol/L）1000倍以上，比正常细胞内浓度高4倍，本课题组前期设计合成的含有二硫键连接臂的还原敏感脂质材料[12]，可以响应肿瘤细胞内的GSH断裂，释放出其中包载的BRAF抑制剂PLX-4032，此外，该材料亲水头部带有三硫酯键作为链转移剂，便于第二步在脂质体表面通过PET-RAFT聚合构建pH敏感纳米凝胶层。
随后，拟在GSH响应的脂质体外表面构建pH敏感纳米凝胶层作为多层次响应型纳米递药系统的外壳，该凝胶层由酸敏感腙键材料（mPEG-HAZ）[13]、链转移剂及PD-1单抗（纳武单抗，Nivolumab）组成，研究表明肿瘤微环境（TME）由于肿瘤的快速增殖与供氧不足导致葡萄糖过度酵解，淋巴循环不畅使酸性物质累积导致pH值范围通常在6.5至6.8之间，而正常组织的pH值为7.4。因此我们可以利用肿瘤微环境偏酸的这一特点[14]，在带有三硫酯键的脂质体外表面应用光诱导电子转移可逆加成-裂解链转移聚合（PET-RAFT）技术[15,16]。由含pH敏感腙键的单体构建纳米凝胶层，含pH敏感腙键的单体响应肿瘤酸性微环境断裂，释放出包载于其中的PD-1单抗。
综上拟构建得到多层次响应型纳米递药系统，外壳响应酸性肿瘤微环境解体释放PD-1单抗，重塑肿瘤微环境，内核被肿瘤细胞摄取后响应GSH释放PLX-4032，改善了联合治疗策略患者的顺应性，增加了药物的靶向性同时降低了药物的全身毒副作用，增强黑色素瘤治疗效果同时为联合治疗策略提供一个新的载体平台。
二、研究内容
本课题首先构建谷胱甘肽（GSH）响应型脂质体，以此作为内核携带BRAF抑制剂PLX-4032；此外，拟构建基于PET-RAFT技术的pH响应凝胶层作为外壳携带PD-1单抗（纳武单抗）；以此形成壳核结构的多层次响应型纳米递药系统，外壳响应酸性肿瘤微环境解体释放纳武单抗，重塑肿瘤微环境，内核被肿瘤细胞摄取后响应GSH释放PLX-4032，增强黑色素瘤治疗效果。该课题将以BRAF抑制剂（小分子抑制剂）及PD-1单抗（蛋白药物）为模型药物，探索多层次响应型纳米递药系统的制备和载药工艺，并对其进行表征。预计本课题的完成将为联合治疗策略提供一个新的载体平台。
