课题背景：
幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，Hp)一种呈螺旋形、微需氧的革兰阴性细菌。能够在酸性环境中生存，该菌常寄生于胃的幽门部，可产生多种酶和多种毒素而致病[1]。目前认为该菌是慢性胃炎、消化 性溃疡的主要病因，与胃腺癌、胃黏 膜相关淋巴组织淋巴瘤的发病密切相关[2]。Hp有鞭毛，在胃内宿主感染Ｈｐ后通过多种机制导致胃黏膜损伤，包括Ｈｐ定植、损害胃黏膜屏障、炎症与免疫反应、毒力基因造成的损害、感染后胃泌素和生长抑素调节失衡所致的胃酸分泌异常等，涉及炎症、免疫、泌酸、氧化等多方面，有毒力因子、细胞因子、自由基、毒力基因等多种 Ｈｐ致病因子参与[3]。随着抗生素在Hp感染治疗中的应用，Hp耐药株的发生率不断上升，以致Hp根除的难度越来越大，Hp根除失败的原因与Hp对抗生素耐药直接相关，Hp耐药株产生的原因是自发突变和通过耐药信息的传递产生新的耐药株，自发突变发生率为1/107。如克拉霉素耐药机制是23S rRNA基因突变，突变的位点大部分在2 144位，也有小部分在2 143位，由A突变成G，突变点可以被Bsal和Bbsl识别[4]。因此，寻找新的抗菌药物，优化治疗方案成为研究的重点。
抗菌肽（AMPs）是一类由生物体产生的具有抗菌活性的小分子多肽的总称，通常由10-50个氨基酸组成，相对分子质量在4000左右，带正电荷，具有较好的水溶性与稳定性，等电点在10-11之间。目前已相继从细菌、真菌、两栖类、哺乳动物和人体内发现抗菌肽。因其对革兰阳性细菌和革兰阴性细菌均具有抗菌活性，且对耐药细菌同样有效，甚至包括携带NDM-1基因的大肠埃希菌。有研究表明，抗菌肽不仅具有广谱抗菌活性，还对病毒、真菌、原虫、癌细胞等具有杀灭作用，甚至能提高免疫力，加速伤口愈合。使其可能成为代替传统抗生素和抗肿瘤药物的一种新型药物[5]。其抗菌作用机制有膜破坏型和非膜破坏型两种，前者主要是抗菌肽和微生物之间通过电荷相互作用，并在细胞膜积累，使细胞膜发生构象变化，进而破坏膜结构完整性，导致细胞破裂，细胞内容物外流。后者是快速穿膜，与细胞内靶分子相互作用，包括抑制核酸复制，干扰蛋白质合成，抑制酶活性或信号传导等生理过程，从而发挥杀菌作用[6]。
Cathelicidins 是一类具有广谱抗微生物活性的多功能抗菌肽。迄今为止, 在几乎所有种类的脊椎动物体内均有发现, 在动物先天免疫系统中发挥极其重要的作用。Cathelicidins 不仅对普通革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌以及病毒具有非常强的抗性, 而且对许多临床分离耐药菌株同样具有作用。Cathelicidins 具有特殊的杀菌机理, 不易产生耐药性。cathelicidins还具有许多其他生物学活性，如对多种免疫细胞具有趋化作用、诱导肥大细胞脱粒和组织胺释放、调节巨噬细胞转录、促进伤口愈合、诱导血管发生、诱导变异细胞系细胞凋亡和淋巴细胞活化等。此外, cathelicidins 结构简单, 溶血活性和细胞毒性小, 因此极具开发潜力[7]。BF-30 是金环蛇 Cathelicidin 基因编码的一种直链多肽，由30个氨基酸构成。已有研究表明 BF-30 在体内体外都对耐药细菌有很高的活性，通过细胞膜透化作用杀死细菌[8]。而Cbf-K16则是通过将BF-30第十六位谷氨酸突变为赖氨酸得到的BF-30突变体，以期提高分子的正电性，从而能更好作用于带负电的细菌细胞膜，增加膜的渗透性，以致细胞快速死亡。研究表明，Cbf-K16具有广谱抗菌活性，尤其是对于耐药菌株。由于作用机制的不同，Cbf-K16与替加环素相比对耐药菌株如NDM-1表现出更高的杀伤活性[9]。不仅如此，Cbf-K16与BF-30相比，对人非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）细胞H460表现出更强的细胞毒性，同时，Cbf-K16并不会对正常细胞产生杀伤作用，这使其有望用于治疗人NSCLC[10]。在体内的实验结果表明，Cbf-K16与头孢他啶/氨苄西林表现出良好的协同作用，两者联用可对菌血症所致的小鼠急性肺损伤起到很好的保护作用。在beta;-内酰胺类抗生素作用下，Cbf-K16可更好地杀伤细菌，尤其是革兰氏阳性菌。这种药物联用可进一步扩大抗菌谱，有望在减少药物剂量、副作用等情况下进行有效的治疗[11]。
本课题根据以上的背景介绍，进行抗菌肽Cbf-K16对幽门螺旋杆菌体外抗菌活性以及相关作用机制的研究。
实验流程：
1. Cbf-K16对幽门螺旋杆菌的最小抑菌浓度（MIC）的测定
采用幽门螺旋杆菌培养基（Hp培养基）测定药物对细菌的MIC值。取无菌96孔聚苯乙烯板，每排1号孔加入100 mu;L无菌Hp培养基作为空白对照，2~12号孔每孔加入50 mu;L新鲜配置的105 CFU/mL左右的菌悬液，2~11号孔各孔分别加入512、256、128、64、32、16、8、4、2 mu;g/mL的药物50 mu;L，此时，各孔中药物浓度分别为256、128、64、32、16、8、4、2、1mu;g/mL。12号孔加入50 mu;L无菌Hp培养基作为阳性对照。将96孔板置37 ℃培养箱中培养16~20 h，以在小孔内完全未见细菌生长的最小药物浓度为最小抑菌浓度MIC值，观察并记录[11]。
