开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
产达托霉素工程菌发酵条件的优化
- 背景：
近 10 年来，革兰氏阳性耐药菌感染的趋势在不断上升，因此，抗耐药菌新抗生素的研究又成为热门课题。达托霉素对革兰氏阳性耐药菌均有很好的杀菌效果，成为“病原菌最后一道防线———万古霉素”的最佳替代品。药理实验表明，达托霉素能在多个方面破坏细菌细胞膜功能，由此迅速杀死革兰氏阳性菌，更重要的是其在体外对甲氧西林、万古霉素和利奈唑胺等耐药性分离菌株仍具强力活性，因此，成为了极具开发价值的新型脂肽类抗生素［1-2］。玫瑰孢链霉菌( Streptomyces roseosporus) 可以产生一系列的有共同母核的环脂肽类化合物，命名为 A21978C 复合物，其中达托霉素是 A21978C 复合物中的 N-癸酰基衍生物，因其活性较高，毒性较小而被开发成药物［3］。A21978C 类化合物是一组包含不同长度脂酰侧链的环脂肽混合物，其发酵过程具有“前体导向”的特点，即在发酵液中添加不同的前体物质，A21978C 混合物中其相应组分的含量也会显著提高［4］。
在发酵液中加入外源性前体癸酸，直接参与达托霉素的合成，可改变菌体次级代谢方向，提高达托霉素在 A21978C 复合物中的比重［5］。癸酸既是发酵产生达托霉素的必需物质，但过量的癸酸会对玫瑰孢链霉菌产生毒性，而当前体癸酸浓度低时则癸酸供应不足会导致发酵液中终产品浓度也会相应较低。因此，除了利用育种手段筛选抗性突变株之外，在发酵过程中进行前体添加控制也十分有必要［6］。
达托霉素先后由 Lilly 公司与 Cubist 公司开发，上世纪80 年代末，Huber 等人对达托霉素的发酵条件进行研究［8］，并开始采用添加癸酸的方式进行前体发酵，以恒速补料控制癸酸补料速率为 16 mmol/L，发酵 280h 使达托霉素产量达到 1. 63 g/L［9］。此后，由于涉及商业机密，国外关于达托霉素菌的研究报道集中在生物合成机理与临床药理方面，有关菌株选育与发酵优化的研究较少公开报道，2000 年Cubist 公司的专利中提及其从 5 500 L 发酵液中可得到达托霉素粗品 9. 9 kg，表明其达托霉素发酵水平已达到工业化规模［10］。
国内有关达托霉素菌种选育与发酵优化的研究起步较晚。天津大学卢文玉等对玫瑰孢链霉菌进行菌株诱变育种，并研究了发酵过程中前体添加问题，最高产量达到摇瓶发酵时 81. 2 mg/L，5L 发酵罐时 258 mg/L［11-12］。北京交通大学采用飞秒激光诱变技术选育达托霉素高产菌株，该菌7. 5 L 生物发酵反应器达托霉素产量达到 371. 40 mg / L［13］。但与国外相比都仍有较大差距。此外，华北制药集团，福州大学，福建微生物研究所、重庆大新药业股份有限公司等单位也进行了相关研究［14-17］。2007 年上海吉尔生化有限公司率先以多肽固相合成的方法全合成达托霉素［18］，但成本过高，目前尚难以放大生产。癸酸是达托霉素生物合成过程中必须的前体物质，但同时癸酸对产生菌的生长却具有毒性，因此如何提高产生菌对癸酸的耐受性，提高产生菌利用癸酸的能力，进而提高达托霉素的生产能力有着十分重要的意义。实验中采用癸酸流加培养获得的达托霉素最高产量达到摇瓶发酵时109. 95 mg / L，与间歇补料相比有很大提高，但与国外先进水平仍有很大差距。下一步可考虑采用发酵罐发酵的方式来提高达托霉素产量。
- 方法
2.1 含量测定
采用 HPLC 法测定发酵液中 1 的产量。色谱条件 ：色谱柱 HanBonC 18柱 (4.6 mmtimes;150 mm，3 mu;m) ；流动相 乙腈 ( 含 0.1％三氟乙酸 )-0.1％三氟乙酸水溶液 (41 ︰ 59) ；流速 1.0 ml/min ；检测波长 223 nm ；柱温 35 ℃ ；进样量 20 mu;l。
2.2 摇瓶发酵
种子培养 ：将成熟斜面的孢子接种到 30 ml 种子培养基 /250 ml 摇瓶中，30 ℃振荡 (220 r/min)培养 32 h。
