解脂酵母的分离和活性研究文献综述

·研究背景

脂肪酶是工业领域应用非常广泛的一类绿色生物催化剂，它对很多手性化合物都具有高立体选择性作用，能进行酯化、转酯化、醇解和氨解等反应，且反应条件温和，催化效率高，环境友好，因此被广泛应用于手性化合物的合成。不同的立体异构体在体内的药效学、药代动力学和毒理学性质不同，并表现出不同的治疗作用与不良反应，研究与开发手性药物是当今药物化学的发展趋势。^[1][2]

微生物是脂肪酶的重要来源之一，其中酵母脂肪酶被认为是非常安全的一类脂肪酶，也是应用最为广泛的一类脂肪酶。^[1]解脂耶氏酵母（Yarrowia Lipolytica）是被美国食品药品管理局认为是最安全的（GRAS，generally regarded as safe）微生物，在食品和医药工业具有广泛的应用前景。^[3][4]

解脂耶氏酵母作为非常安全且广泛存在的一种微生物，理论上，它所产的脂肪酶也可用于手性药物的拆分。其表达系统具有以下优点：质粒能进行多位点整合，且遗传稳定；能够分泌多种蛋白质；适合表达复杂的蛋白质；蛋白质低度糖基化，与哺乳动物较接近；培养成本低，适合工业生产；生长速度快，适合高密度发酵。^[4]由此可见，解脂耶氏酵母可能比之前所研究过的微生物更适合医药工业生产手性药物。

布洛芬是一种重要的2-芳香丙酸类非甾体抗炎药，其分子结构中alpha;位为手性碳原子，因此产生了R-布洛芬和S-布洛芬两种异构体，后者的生理活性是前者的160倍^[5]。布洛芬的抗炎作用主要是由S-布洛芬产生，它通过抑制前列腺素的合成起解热镇痛的作用，而R-布洛芬和辅酶A形成的酯会干扰正常的脂代谢和膜功能，具有一定的毒副作用。^[6]因此，在布洛芬的生产过程中需要对消旋体进行拆分。化学拆分方法通常存在反应路径长、重金属催化剂残留和收率低等缺点，而且手性试剂价格昂贵，成本较高。与之相比，非水相中的微生物酶法拆分则有较好的稳定性、对映体选择性和广泛的底物特异性，兼有路径短、成本低、污染少等优点，^[5]这使得脂肪酶在光学纯化合物制备和药物手性转换中具有独特的优势。

此前已有过不少微生物脂肪酶法拆分布洛芬的研究，如圆柱状假丝酵母、皮状丝孢酵母T158、扩展青霉TS414等等。^[5][6]通过建立不同的培养条件（包括蛋白胨浓度、酵母膏浓度、葡萄糖浓度、吐温、培养基pH、生长过程及培养时间、不同碳源等）和不同的反应条件（包括水分、温度、pH、有机溶剂、酶浓度、醇结构和醇浓度），探索获得最佳水解活性和拆分专一性的条件^[7]-[10]。

由于时间原因，本次实验将着重于从自然环境中分离得解脂耶氏酵母并对其拆分手性化合物的作用进行初步验证。

·实验方法

根据所查文献，解脂耶氏酵母的来源按含量从高到低的顺序排列大致有奶酪、奶或乳、酸奶、黄油、香肠、火腿、培根、牛肉、禽类、鱼类等^[11]，此外海水或海洋生物体内也含有较多的解脂耶氏酵母^[12]。考虑到获取途径与操作过程的难易，以及市面上奶制品多数为再制产品，因此我主要选择了猪肉、鸡肉、牛肉、鱼鳃、香肠、培根、奶酪等作为样品，定量取样后加入到YPD液体培养基中进行增菌培养2-3天，然后依次进行平板涂布培养、平板划线培养，以期获得单菌落，再将单菌落转接至YPD培养基斜面进行培养，2-3天后通过美兰染色、显微镜下观察其形态等来对所分离得到的菌株进行鉴定，然后将其保藏，以供后续实验验证解脂耶氏酵母发酵所产脂肪酶在手性化合物拆分过程中的作用^[12]-[14]。

从样品中分离出菌株后，首先要筛选产脂肪酶的菌株。主要是将聚乙烯醇-橄榄油乳化液加入到灭菌后的培养基中，即成为产脂肪酶菌株的初筛培养基。观察菌株在初筛培养基中形成的水解圈的大小进行筛选。