开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
课题背景：
最新进展和申请者的前期研究表明，喉癌细胞中存在极少数具有无限增殖、自我更新及多向分化潜能的肿瘤干细胞(Cancer stem cells, CSCs )，它们是喉癌的种子，是喉癌细胞无限增殖、复发和转移的根源；其余的大多数喉癌细胞，只维持肿瘤的体积，无增殖能力或只有有限的增殖潜能，它们经过短暂的分化，最终凋亡或死亡[1－2]。以往的喉癌研究都是把肿瘤体内的细胞作为一个整体，认为同一瘤体内的肿瘤细胞均具有相似的生物学特性，喉癌肿瘤干细胞的发现，突破了传统的肿瘤研究模式，为研究喉癌的发生发展及治疗提供了全新的视角。
新近，国内于丹、金春顺等[ 3-4] 他们的研究表明，喉癌干细胞高表达自我更新调控重要因子Bmi-1，该基因可能是喉癌发生、发展、浸润、转移和复发的关键因素之一。Prince和Chen Y-C[5-6]等的研究也表明，头颈肿瘤干细胞无论在基因水平还是蛋白质水平均有Bmi-1基因表达上调，该基因被证实与癌变的发生有密切关系，沉默Bmi-1基因可以使头颈肿瘤干细胞对放化疗的敏感性明显增加。
RNA干扰(RNA interference，RNAi) 是一项高效、特异、彻底的转录后基因沉默技术，已成为基因治疗的强大工具。然而，未经包裹修饰的单纯核苷酸片段为亲水性的聚阴离子，对生物膜的通透性差，体液中易受核酸酶的攻击而降解，并且对肿瘤组织缺乏靶向性，不能有效导入目的细胞。因此，设若能获得高效、特异、安全的运载方式及投送系统，RNA干扰技术有望靶向杀伤肿瘤干细胞的目的基因，实现肿瘤干细胞的靶向治疗。
纳米技术的出现，有望解决这一难题。纳米粒是指大小在10～1000nm之间的固态胶颗粒，一般由天然高分子物质或合成高分子物质合成。纳米粒子具有小尺寸效应，表面效应及很强的吸附性和生物活性，纳米载体可生物降解，无免疫原性、无细胞毒性和遗传毒性，是基因治疗的理想载体，研究表明，正常组织的新生血管与肿瘤组织的新生血管的区别就在于后者具有一定的渗漏性，绝大多数的肿瘤组织其血管具有“小孔”，直径一般在380至780 nm之间，纳米粒子可以穿过此毛细血管、组织间隙及组织内皮细胞，将药物在细胞或亚细胞的水平上释放，而正常组织的血管内皮细胞间隙较小，纳米粒子不能穿过，这也为纳米粒子运输抗癌药物靶向进入肿瘤组织提供了可能[7]。Yogesh Patil等合成聚乳酸共聚乙醇（PLGA）-多聚乙酰亚胺（PEI）-模型基因RNAi，研究证实，作为基因干扰载体的纳米微粒具有安全、无毒的特点，其细胞摄入率高，基因沉默效果显著，是理想的基因治疗载体[8]。Changxing Liu等用聚乙二醇-脂质体纳米载体，运载多药抗药基因（MDR1）的siRNA（小干扰RNA），靶向沉默结肠癌肿瘤干细胞中的多药抗药基因1，成功敲除MDR1基因，使CD133 结肠癌肿瘤干细胞对化疗药物紫杉醇的敏感性明显增加[9]。
既然喉癌细胞中存在肿瘤干细胞，喉癌干细胞中Bmi-1基因高表达，且与其自我更新密切相关，可以设想，使用高效的基因运载工具，靶向敲除Bmi-1基因，就可以有效阻断喉癌干细胞的增值和分化，促使其死亡，使喉癌的的根治成为可能。基于以上述假设，设计本研究：首先构建Bmi-1RNAi重组质粒载体，转染喉癌干细胞，筛选出最佳的shRNA；制备壳聚糖-聚乙二醇(CS-PEG)纳米粒，透射电镜、激光粒度分析仪考察其形态、粒径、电位，MTT法考察其细胞毒性，基因保护实验考察药物的理化特性，从而为靶向杀伤肿瘤干细胞纳米药物的研制奠定基础。
实验流程：
1.Bmi-1RNAi重组质粒载体的构建及评价
1.1 设计、合成了Bmi-1的shRNA、与pGenesil-1质粒载体链接构建重组质粒，通过酶切电泳、基因测序证实构建正确。
