开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述）
一、文献综述
随着生物技术日新月异的发展，有效的基因功能研究手段无疑是研究人员关注的焦点。目前，利用各种转基因技术在宿主染色体上进行基因敲除、基因敲入和外源蛋白过量表达等研究，已经成为基因功能研究最为常用和有效的方法之一[1]。
遗传工程中的重组技术可分为转座重组、非同源重组、同源重组以及位点特异性重组。由转座子介导的转座重组尽管有较高的插入效率，但外源基因的插入位点无法控制，转基因不具备靶向性，易受整合的位置效应影响，导致该重组技术在基因表达以及基因功能研究方面出现一些无法克服的缺点；利用病毒等介导的随机重组不但重组效率较低，而且也具有随机整合而不具靶向性的缺点；利用同源重组虽能克服随机整合不具有靶向性的缺点，但单个基因或特定的DNA片段同源重组发生率较低。位点特异性重组技术是近年新发展起来的一项重要分子生物学技术，其借助特异位点重组酶，在基因组和外源DNA上的重组酶特异识别位点间进行基因操作，可实现基因置换、倒置和组织特异性敲除等。由于位点特异性重组技术能够有效克服诸如同源重组、非同源重组以及转座重组等其他类型重组技术的重组效率低、随机整合而不具有靶向性以及易受整合的位置效应影响等缺点，逐渐被广泛应用于各种生物特别是高等真核生物的基因工程操作[2]。
目前研究和运用最多的位点特异性重组系统主要是Cre/loxP、FLP/FRT和Phi;C31-Int这3个系统[3]。来源于P1噬菌体的Cre重组酶具有广泛的适用性，能够识别并催化多种拓扑结构的Lox序列间的重组反应，在哺乳动物细胞、小鼠、酵母、斑马鱼等多种高等真核生物中表现出良好的催化活性。由于其具有较高的重组效率和靶向性，已被广泛用于实现基因敲除、基因敲入、点突变、缺失突变、染色体大片段删除等基因工程操作。
Cre 重组酶是由Sternberg等于1981年从P1噬菌体中发现的[4]，属于lambda; Int酶超基因家族。其基因编码区序列全长1029bp（EMBL数据库登录号X03453），编码38kDa蛋白质[5]。Cre 重组酶是一种位点特异性重组酶，能介导两个34bp的loxP 位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。来源于P1噬菌体的野生型Lox（Loxp位点），全长34bp，包含两个13bp反向重复序列（Inverted repeats）和一个8bp的非对称间隔区（Spacer）序列共同组成，13bp的反向重复序列是Cre酶的识别和结合区域，8bp的间隔区是DNA链的断裂与重接等重组交换过程发生的区域，间隔区序列的不对称性显示整个Loxp位点具有方向性[6，7]。其序列为：5 - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3[8]。
另外，Cre不仅可以识别LoxP的2个13bp的反向重复序列和8bp的间隔区域，而且当一个13bp的反向重复序列或者8bp的间隔区发生改变时仍能识别并发生重组。利用这一特点，人们在构建载体时可以根据需要改造LoxP位点序列，以用于特定的基因突变或修复，增加了该系统的应用范围。
Cre重组酶在体内介导重组发生的唯一条件是Cre蛋白的存在，不需要其他辅助因子协同，该特性使得Cre成为遗传操作的有力工具，在哺乳动物细胞、小鼠、酵母、细菌、植物中都有广泛的应用。在转基因动物研究领域，利用Cre/LoxP系统克服外源基因随机整合所带来的不确定性，建立不同的基因缺陷型小鼠作为人类疾病动物模型，将对人类疾病的临床及病理研究提供极大的便利。利用Cre/LoxP系统建立起含有特定接纳位点（lox位点）的转基因动物系，通过Cre重组酶介导待研究的外源基因在接纳的定点整合，从而有效地克服位置效应对基因功能研究的影响。Cre/LoxP系统还被用于介导转基因植物中标记基因的删除，以达到提高转基因作物的安全性的目的。而且，利用Cre/LoxP系统建立可诱导的组织特异性Cre重组酶表达系统，可实现对基因靶位点时空上的精确调控，为发育生物学、遗传学、免疫学及医学等学科领域提供了全新的研究手段。
Cre/LoxP系统的出现推动了位点特异性重组技术在基因工程研究领域的发展，使基于位点特异性重组的基因打靶技术在理论研究与实践应用方面都日趋成熟。由于Cre/LoxP重组系统可以迅速而有效地实现各种生理环境下的基因定点插入、删除、替换和倒位等操作，是条件性基因打靶、诱导性基因打靶、时空特异性基因打靶策略的技术核心，其已成为哺乳动物基因工程研究领域应用最为成熟与广泛的位点特异性重组系统。
本试验拟将Cre/LoxP系统应用于转基因动物体细胞中的定位插入与表达研究。G114A为来源于表达重组人溶菌酶基因山羊的体细胞，其溶菌酶基因整合位点含有两个Loxp位点，可用于基因遗传操作。本研究借助于Cre/LoxP重组系统，将报告基因（红色荧光蛋白RFP基因）定位插入山羊成纤维细胞的染色体上，以实现报告基因（RFP基因）在山羊染色体的精确整合与定位表达，检测其定位整合效率及定位表达效果，为后续生产具有商业价值的转基因动物、揭示疾病发生机理和探寻疾病预防与诊疗方法等多方面的生物工程应用奠定基础。
