产均一分子量透明质酸枯草芽孢杆菌的发酵工艺条件优化文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一、研究背景：

透明质酸（Hyaluronic acid，HA）是糖胺聚糖中的一种，属于酸性粘多糖，广泛分布于人体的各个部位，其中皮肤含有大量的透明质酸。1934年美国哥伦比亚大学教授Meyer等人首先从牛眼玻璃体中分离出透明质酸。在体内透明质酸是一种多功能基质，显示出多种重要的生理功能，例如调节蛋白质，协调水电解质的扩散及转运，润滑关节，调节血管壁的通透性，促进伤口愈合等等。尤为重要的是，透明质酸既有特殊放报税作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子。透明质酸由于其具有独特理化性质和生理功能，已经在医学、生物材料方面得到了广泛应用^[1,2]。

卡尔迈耶实验室在20世纪50年代阐明了透明质酸的化学结构，透明质酸是一种高分子的聚合物，是由单位D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖糖胺组成的高级直连粘多糖。D-葡糖糖醛酸及N-乙酰葡萄糖胺之间由beta;-1，3-糖苷键相连，双糖单位之间由beta;-1，4-糖苷键相连，分子中两种糖按1：1的摩尔比组成，双糖单位可达25000之多。在体内透明质酸的分子量从5钱到2千万道尔顿。不同分子量的HA具有不同的生物功能。^[1]高分子量HA(HMW-HA)具有的高度粘弹性、可塑性、渗透性和良好的生物相容性，临床上透明质酸主要进行膝关节腔内注射透明质酸治疗骨关节炎，既可以关节滑液中形成的粘弹性对关节软骨起着减震和润滑等机械保护作用，又能够与靶细胞的受体结合发挥对滑膜炎症的抑制作用及对关节疼痛的缓解作用^[2]。低分子量HA(LMW-HA)及寡聚HA(Oligo-HA)具有促血管生成、促进创伤愈合、抗肿瘤及免疫调节等生物活性，其中4糖的透明质酸片断具有上调Hsp72表达、上调Fas表达、抑制细胞凋亡等活性；6糖的透明质酸对树突状细胞中细胞因子的合成具有促进作用；10个单糖单位的透明质酸具有上调肿瘤细胞中PTEN水平的作用； 8～32个单糖单位的透明质酸具有促血管内皮细胞生成作用；10～40个单糖单位的透明质酸具有促肿瘤细胞迁移作用^[2]。但无论是高分子量的长链多糖还是低分子量的寡聚片段，良好的均一度才是多糖行使其生物功能的基础

然而遗憾的是，制备均一度良好的透明质酸在世界范围内仍然是未解决的难题，围绕多糖活性成分确认、构效关系研究等方向的探索因此严重受阻。目前制备透明质酸这一重要粘多糖的主要方法是利用工程菌进行发酵生产^[3-7]。这种方法虽然具有成本低，产量大的优点，但是所得透明质酸成分极其复杂(含杂蛋白、菌体杂质及其他糖类物质等)，分子量分布于10⁴～10⁷的范围内，均一度较差，远远不能满足食品级和医用级别的要求。而利用透明质酸酶降解法制备均一透明质酸也存在底物特异性差，降解产物过短不易纯化的问题。局限于化学合成的策略不可行性和分离纯化的难度及成本考虑，此类尝试从未能成为实质性解决方案。另外，利用来源于禽多杀性巴氏杆菌的透明质酸合成酶PmHAS进行外源添加单糖底物进行一定长度均一透明质酸的化学酶法合成探索，尽管能制备均一长度透明质酸，但是也存在着合成成本高，仅能合成寡聚透明质酸，产量过小无法扩大生产等问题。

二、研究目的和意义：

本课题在本实验室对Ⅱ类透明质酸合成酶PmHAS（重组巴氏杆菌透明质酸合成酶）研究工作基础上，利用已经运用基因工程方法构建成功的含有PmHAS以及透明质酸合成途径当中的关键酶基因tuaD和gtaB的枯草芽孢杆菌工程菌株，进行发酵生产透明质酸。通过对产量，产率，产物分子量等方面的影响进行考察并做相应的优化，以期达到制备出足量、纯净、分子量均一的透明质酸的目的，为解决体内合成均一透明质酸这一阻碍其应用和研究发展的难题打下基础，同时也为透明质酸体内合成分子量调控机制的研究提供帮助。

三、实验内容

1.透明质酸（HyaluronicAcid，HA）含量测定

根据Yong-Hao Chen 等^[8]报道的一种利用改良CTAB浊度法测定发酵液中透明质酸浓度的方法，取1ml不同浓度的HA标准溶液在25℃以上的条件下，与2ml、 2.5g/L的CTAB溶液^[9]以及PH6.0的乙酸缓冲液混合后震荡，在25℃以上的条件下反应10min，然后在400nm下测得其吸光度，以未接种的培养基经相应处理后作为空白。以HA的浓度对吸光度做图，制作其标准曲线。