开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、研究背景、目的及意义
表皮生长因子受体-2（HER-2）受体是一种在胚胎发育时期就存在的肿瘤相关抗原，在肿瘤细胞上过度表达。数据显示，其与肿瘤细胞的迁移能力，癌症复发风险和不良预后有关。同时，HER-2在肿瘤细胞表面过度表达，会产生对抗癌症免疫治疗极好的靶向作用。因此，针对HER2的单克隆抗体与络氨酸激酶抑制剂研究领域逐渐兴起，并有相关产品上市，如单克隆抗体曲妥单抗，并已证实其对癌症被动免疫治疗的作用。但是，由于曲妥单抗主要针对HER2膜外结构，具有治疗局限性，且带有一定心脏毒性，对使用氨茴环霉素的患者限制使用。
为了解决曲拓单抗的局限性，研究抗HER2疫苗成为新的思路。研究显示，在携带HER2高表达肿瘤的患者体内存在对HER2的细胞免疫与体液免疫，并可以在疾病早期，延缓肿瘤的生长。并且，患者使用疫苗激发或诱导已存在的抗HER2免疫反应具有多个优势：1.更少的注射次数2.更大的使用范围3.证明记忆免疫反应可阻止疾病复发。然而，由于免疫表位多态性，使HER2疫苗在适用人群方面也受到限制，如：针对HER2/neu的E75多肽疫苗是针对HLA-A2等位基因的抗原肽疫苗，虽然HLA-A2是人群中最为常见的基因型，但仍有大约50%的非HLA-A2型患者能对E75多肽疫苗不敏感。
通用T表位是一种是11-18个氨基构成的序列，可以和不同小鼠MHC亚型H-2k、H-2d、H-2d和人HLA亚型HLA DP、DQ、DR 等分子结合，打破MHC II亚型分子的限制，刺激CD4 的Th细胞增殖分化，辅助产生CTL效应和高滴度抗体。目前主要用于表位肽疫苗和融合蛋白疫苗的研究中。因此，本课题拟对HER2-PADRE蛋白进行分析及设计，完成融合蛋白的构建、表达和纯化，以得到纯度较高的产物，为研究突破MHC II亚型分子限制的HER2疫苗提供基础。
二、研究方案
(1) HER2-PADRE融合蛋白的选取和目的基因的设计：a) 通过相关文献调研（从CNKI、NCBI、Elsevier等数据库调研相关文献），了解HER2、PADRE相关性质和作用；b)利用http://www.uniprot.org/ 在线软件，对HER2胞外，跨膜及胞内区进行区分，并对其性质进行分析。选定胞外区部分氨基酸序列。c)利用http://web.expasy.org/protparam/在线软件，对选定的HER2-PADRRE氨基酸序列的等电点，分子质量，疏水性，氨基酸组成和稳定系数进行分析。
d)利用DNAWORK 在线软件，以大肠杆菌常用密码子为基础，对HER2-PADRR氨基酸序列进行密码子的优化。(2)pET28a-HER2-PADRR的构建与表达：a)将优化好的cDNA进行合成，并将其克隆到pET28a表达载体。b)将pET28a-HER2-PADRR转化BL21DE3大肠杆菌，并对表达条件进行摸索。
c)对HER2-PADRR蛋白的表达量进行优化，并大规模发酵。
(3)HER2-PADRR的分离纯化 ：
a)将收集到的菌体进行超声破碎，并对蛋白的表达形式进行鉴定 b)运用亲和层析，离子交换层析，超滤等方法对目的蛋白进行纯化。
c)通过SDS-PAGE对纯化的蛋白进行纯度鉴定。
三、研究难点
人HER2胞外区和鼠HER2胞外区同源性只有85.56%，存在较大的人鼠差异，因此准确的选择HER2胞外某段序列，使人鼠存在较小差异，并能有效引起免疫反应是本课题的研究难点。
四、进度安排
2016.2-2016.3：检索、阅读相关文献，理解本课题的内容和意义，分析本课题的工作，完成准备工作；
2016.3-2016.5：HER2-PADRR蛋白的构建和表达纯化初步研究；
2016.5-2016.6：总结所做的工作，完成论文写作，并准备答辩。
五、文献综述
关于以HER-2为靶点的肿瘤疫苗的研究进展
摘要：随着免疫学的发展，免疫治疗已成为肿瘤治疗新的研究热点。肿瘤疫苗主要通过调节机体的免疫反应，促进T细胞增殖和活化及细胞因子释放发挥作用，可以显著抑制肿瘤生长和转移，临床试验结果显示已取得一定效果。原癌基因HER-2（human epidermal receptor）是表皮生长受体因子家族成员之一，在多种肿瘤组织中异常表达，使其成为抗肿瘤治疗的理想靶点。本文针对以HER-2为靶点设计的肿瘤疫苗研究进展进行综述，为其进一步开发和临床使用提供参考。
关键词： HER-2；免疫治疗；肿瘤靶向疫苗
上世纪60年代，人们用灭活的肿瘤细胞或灭活的近交系异体肿瘤细胞免疫大鼠，发现可诱导大鼠对同一肿瘤产生移植排斥，由此推测在肿瘤细胞中存在肿瘤特异性抗原，因此产生制备肿瘤疫苗的想法［1-3］。免疫系统能够通过识别肿瘤抗原区别肿瘤细胞和正常细胞，疫苗通过表达特异性的、具有免疫原性的肿瘤抗原( 如蛋白、多肽、DNA 和RNA)，在细胞因子等辅助下，能激活或加强机体自身抗肿瘤免疫，进而杀伤和清除肿瘤细胞。
原癌基因HER-2（human epidermal receptor）人类表皮生长因子受体2,又称作ErbB2或neu，是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体样蛋白，由胞内酪氨酸激酶区和胞外配体结合区组成。属于酪氨酸激酶受体的表皮生长因子受体家族。HER-2 由于缺少结合位点，所以没有与其特异性结合的生长因子，但是其可以和其他表皮生长因子家族的受体结合形成异二聚体，增强其他表皮生长因子受体家族的成员同其相应配体结合的能力。HER-2 是表达于胚胎发育过程中的一种肿瘤相关抗原，在成人主要表达于恶性肿瘤中。一般表达于大约15%的侵袭性乳腺癌、54%-100%的结直肠癌、25%的卵巢癌、17%-82%的胰腺癌以及34 %的前列腺癌中[4-6]，并且HER-2的过表达与肿瘤的侵袭性有关，因此增加了复发的几率并降低了预后[7]。正因为HER-2过表达于肿瘤细胞表面，它就为抗肿瘤的免疫治疗提供了很好的靶位[8]。本文就目前针对HER-2靶点的主动免疫疗法其中的肽疫苗、蛋白疫苗、树突状细胞疫苗及DNA疫苗研究进展进行综述。
