【课题名称】假基因CYP4Z2P与功能基因CYP4Z1之间的ceRNA网络调控乳腺癌凋亡的机制研究【研究目的】1. 研究假基因CYP4Z2P与功能基因CYP4Z1之间的ceRNA网络对细胞凋亡的作用2. miR-125a-3pdd对乳腺癌细胞凋亡的作用【研究方法】1、 流式细胞术（1） 弃去上清，用预冷PBS洗两遍，再用不含EDTA的胰酶消化，消化不能太过，以免产生假阳性，300g 4℃离心5分钟收集细胞；（2） 用预冷的PBS洗涤细胞两次，轻轻吹匀，每次均在300g 4℃离心5分钟；（3） 加入400mu;L 1Binding Buffer重悬细胞（轻轻弹匀）；（4） 加入5mu;L Annexin V-FITC，轻轻混匀，避光，室温反应10min；（5） 再加入5mu;L PI Staining Solution，轻弹匀；（6） 样品在1小时内用流式细胞仪检测。
激发波长为488nm；FITC的绿色荧光在FL1通道检测；PI的红色荧光在FL3通道检测。
用CellQuest等软件进行分析；绘制双色散点（two-color dot plot），FL1为横坐标，FL3为纵坐标。
每个样采集10000events。
典型的实验中细胞可以分成三个亚群：活细胞仅的背景荧光强度较低；早期凋亡细胞有较强的绿色荧光；晚期凋亡细胞则有包括绿色和红色荧光的双重软色。
2、 western blot（1）取30 mu;g蛋白质样品，进行10% SDS-PAGE电泳；（2）湿转电转移法将凝胶上的蛋白质转移到PVDF膜上，恒流 200 mA，180 min；（3）将PVDF膜用封闭液室温封闭2 h；TBST洗膜3次，每次10 min；（4）加入hTERT、bcl2、Bax和beta;- actin一抗，4 ℃过夜；TBST洗膜3次，每次10 min。
（5）加入二抗，室温孵育1 h；TBST洗膜3次，每次10 min。
（6）在暗室中，将PVDF膜蛋白面朝上放在板上，向表面均匀滴加ECL发光液，反应5 min；（7）放置暗盒中曝光0.5~5 min（视条带光强度而定）；（8）采用凝胶图象分析软件Quantity One对X光胶片扫描结果进行分析，用目的蛋白条带的光密度与beta;-Actin内参条带的比值作为目的蛋白表达定量指标，蛋白相对表达水平用RE来表示。
目的蛋白的相对表达率(RR)按以下公式来计算：RR=RE(实验组)/RE(对照组)100%【文献综述】乳腺癌是最常见的恶性肿瘤之一，是引起女性死亡的第二大肿瘤[1]。
