1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1叶绿体及其逆向信号简介
叶绿体在光合作用和相关细胞代谢途径中具有重要作用。叶绿体的发育，稳态的维持和功能取决于叶绿体和核基因的协调表达。叶绿体有自己的基因组，只编码约100个基因，但是在叶绿体中存在超过3,000种蛋白质。因此，超过95 ％的叶绿体蛋白由核基因组编码，在胞质溶胶中翻译并翻译后导入叶绿体。叶绿体自身编码的和核编码的蛋白质需要组装才能得到功能性光合作用和代谢蛋白质复合物。因此，叶绿体和核基因组之间基因表达需要紧密协调，这对于叶绿体发育，生理状态的维持以及维持光合作用的反应都是必不可少的。
叶绿体发育和基因表达主要是由核编码蛋白调节，但细胞核中定位于叶绿体蛋白的基因的表达需要从叶绿体到细胞核的逆行信号来调节。这种逆向信号的调节维持了叶绿体细胞器的功能和代谢状态，并且能够维持叶绿体功能在最佳水平上响应代谢产物的通量和环境条件的变化。尽管叶绿体中信号的来源已经被鉴定，并且对应在细胞核中的相关转录因子也被广泛研究，但是将叶绿体信号传递到细胞核的分子机制仍然是个谜[1]。
叶绿体也是植物在响应外界中起到重要作用的质体。在对环境胁迫的适应过程中，叶绿体和细胞核之间的有效通讯是多样化的细胞代谢和生物合成功能所必需的。近年来，从质体释放的调控核基因的逆行信号已被鉴定出来，并提出了信号通路。叶绿体在应激反应中释放的四吡咯、类胡萝卜素、活性氧(ROS)等逆行信号对植物应激反应基因表达的逆调节、系统获得性适应和细胞协调中都有着重要的作用[2]。
2参与生物逆行信号传递的关键蛋白
2.1 LSD1在叶绿体活性氧状态调节和抗性基因表达方面的作用
LSD1是一种活性氧诱导的细胞死亡，病原体诱导的过敏反应(HR)，基础病害抵抗的负调节因子。并且LSD1可能在活性氧生成之前，超氧化物的积累过程中发挥了解毒作用。而超氧化物的积累会触发级联反应导致细死亡。lsd1突变体在病原感染部位会产生SA依赖的过敏性细胞死亡，即表现为无法控制地相邻细胞中细胞死亡的扩散。lsd1突变体在长日光周期中病变部位会导致典型的RCD表型[3,4]。LSD1对于适应光氧化应激的条件也是必需的。lsd1突变体无法适应过量激发能量(EEE)的光照条件，而其中重要的过氧化氢酶的高活性需要LSD1蛋白。所以lsd1植物在长日光周期和高强度光照下具有较低的气孔导度和较低的过氧化物酶体过氧化氢酶活性，这使得它们在EEE胁迫期间易于产生ROS过载的胁迫[7]。所以根据以上我们认为，LSD1可以影响光呼吸在耗散EEE中的有效性，因此可能是植物适应病原胁迫等过程的关键决定因素。而SA会诱导气孔关闭，抑制过氧化氢酶活性并触发lsd1中的RCD表型。所以SA也会损害野生型植物对EEE的条件的适应[8]。
在病原体感染或外源SA的作用下，植物内源SA的积累和NON-EXPRESSOROF PATHOGENESIS-RELATED GENE 1(NPR1)，NPR1是lsd1-like RCD所必需的[5]。NPR1是响应SA的局部或系统获得性抗性（systemicacquired resistance, SAR）的关键调节因子。SA的积累改变了NPR1的氧化还原状态。变为单聚体的NPR1再从细胞质穿梭到细胞核激活相关转录因子[6]。拟南芥SIGMA因子结合蛋白1(SIGMA FACTOR-BINDING PROTEIN 1, SIB1)基因的表达由SA的诱导表达依赖于NPR1蛋白。SIB1蛋白在响应SA时快速积累，并移动到至细胞核和叶绿体。现在发现叶绿体定位的SIB1蛋白与SIGMA因子1(SIGMA FACTOR 1, SIG1)相互作用，SIGMA因子1是负责质体基因转录的RNA聚合酶的组成部分，会抑制光合作用相关的质体基因表达[9]（图1）。
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图1 lsd1突变体中通过SA依赖的RCD表型调节通路
2.2 Gun基因的定义及其在叶绿体逆向信号中的表型
另一方面，研究叶绿体与细胞核之间信号传递的蛋白GUNs。在幼苗中加入类胡萝卜素生物合成抑制剂 (nflurazon, NF) 会导致已经证明了几种光合作用相关核基因(PhANGs)的表达量降低和叶绿体功能的丧失[10]。由于叶绿体的光漂白而产生的叶绿体到细胞核的逆行信号，在连续光照和施加NF的条件中生长的野生型植物中由LIGHT-HARVESTINGCHLOROPHYLL A/B BINDING PROTEIN 1.2 (LHCB1.2)启动子驱动的报告基因（例如GUS和LUC）表达量会降低[11]。但是一些突变体在含有NF的培养基上虽然叶绿体光漂白的，却具有高水平的LHCB表达。从这些突变体中初步筛选，研究鉴定了几个在逆行信号传导中存在突变的基因，并命名为genomesuncoupled (gun)突变体[12]（图二）。
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图2 光合相关基因在gun1突变体中表达协调
gun突变体在植物施加了NF之后会解除野生型中抑制LHCB的表达的表型，表明了突变体中逆行信号传导受到了损害。除GUN1外，GUN2，3，4，5和6直接参与四吡咯合成，表明四吡咯与逆行信号传导紧密相关。而GUN1是一种核编码的质体中的含聚三角状五肽（PPR）蛋白，在多种质体信号的整合中发挥作用，如活性氧（ROS），质体基因表达和糖信号。一直以来，我们都认为GUN1与各种生物过程有关。然而，GUN1关于多质体信号整合的作用方式仍然有待进一步研究[13]。
2.3 转录因子GLKs对核光合相关基因表达的调控
转录激活因子GLKs作为细胞核光合相关基因的激活剂参与叶绿素生物合成，光捕获和电子传递的。以细胞自主方式起作用以协调和维持细胞个体内的光合作用。转录因子AtGLK1的表达水平与质体蛋白导入缺陷的突变体中光合作用相关核基因的表达紧密相关。此外，当质体功能失调时，GUN1的活性似乎下调AtGLK1的表达[14]。与发育不良的叶绿体一致，glk1glk2突变体表现出核编码光合基因的转录和蛋白水平降低，尤其是那些与叶绿素生物合成和光捕获相关的基因[15,16]。拟南芥中的GLK1过量表达会增强编码病程防御相关蛋白的基因的组成型高表达。这些基因包括PR10、异分泌酸合成酶、抗菌肽、糖基水解酶，MATE外排和其他与病原体反应和解毒相关的基因[17]。
2.4 对GUN1在LSD1信号通路中的作用的猜测
Kim的实验室发现SIB1增强了PhANGs（包括LHCB基因）的表达，而光合作用相关的质体基因(PhAPGs)基因如PsbA和PsbB的表达则会被抑制。PhANGs和PhAPGs的这种解偶联表达与lsd1突变体中的损伤形成有关。也就是说lsd1突变体相比于野生型，PhANGs的表达量会提高，而PhAPGs的表达量反而会降低。由于gun1突变也会导致PhANGs表达的提高，所以我们猜测与lsd1相比，lsd1 gun1突变体中lsd1介导的PhANGs和PhAPGs的偶联表达量变化的表型可能会增强。
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同时LSD1和GUN1都会影响蛋白质GLKs的表达。而GLKs同样会影响PhANGs和PhAPGs的偶联表达量（图三）。因此，我们猜测LSD1和GUN1可能在相同的信号通路下发挥作用，并且lsd1gun1突变体的植物在连续强光下表型是更加严重的RCD。
图三 LSD1和GUN1对GLKs的影响
研究植物叶绿体的逆向信号，就可以了解到植物在逆境如何通过代谢调节来平衡细胞的稳态。并且GUN1蛋白的信号通路到目前为止依旧没有人能够解释。如果我们能够发现LSD1和GUN1在相同的信号通路中发挥了作用，也许对GUN1信号通路的研究可以多了一种方向，这对于解释植物细胞逆向信号有着重要的作用。
参考文献：
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1研究的目标
构建得到lsd1 gun1突变体，lsd1 glk1 glk2突变体，lsd1 gun1回补gun1-gfp的突变体，然后通过鉴定不同突变体的rcd表型，在胁迫下相关相应水杨酸(sa)基因（sargs）表达量与免疫相关蛋白质翻译情况pr1, pr2，来研究gun1和glk1 glk2对拟南芥lsd1突变体导致中rcd的影响。
2研究内容
3. 研究的方法与方案
1 研究方法
1.1植物材料和生长条件
所有拟南芥种子均来源于Columbia-0(Col-0)型，在连续光照(CL)（100 μmol·m-2·s-1）、22±2 C条件下生长。所有的突变株都是通过与纯合植株杂交而获得的。lsd1 gun1回补GUN1-GFP通过构建载体，杂交获得。根据对Basta的抗性筛选出纯合子，并对所有突变株的基因型通过LSD1引物和GUN1引物（表一）进行了PCR鉴定。
表一 引物及其序列
| 引物名称 | 位点 | 引物序列 |
| LSD1-LP | At4g20380 | CTGGGATTTGTAAAGCAGCTG |
| LSD1-RP | At4g20380 | TCAAGTTCCATGGAGCAAAAG |
| LBb1.3 | universal | TAGCATCTGAATTTCATAACCAATCTCGATACAC |
| GUN1-LP | AT2G31400 | ATGCTGCATATCAGATTTCGG |
| GUN1-BP | AT2G31400 | GTGGGTTCTGCTGTTTCTTTG |
| LB3 | universal | TAGCATCTGAATTTCATAACCAATCTCGATACAC |
种子表面消毒用1.6 次氯酸盐溶液浸泡10 min，然后用无菌水冲洗5次。种子接种于Murashige和Skoog(MS)培养基 0.65 (w//v)琼脂上。在4 C黑暗条件下处理2天后，将种子置于生长室内，在22 C±2 C条件下，光照强度维持在100 μmol·m-2·s-1。
1.2蛋白质提取和免疫印迹分析
用提取缓冲液[20 mM Hepez(pH7.4), 2 mMEDTA, 2 mM EGTA, 25 mM NaF, 1 mM Na3VO4，50 mM磷酸甘油，10 (v/v)甘油，20 mMHepez(pH7.4)，2 mM EGTA，25 mM NaF，1 mM Na3VO4，50 mM磷酸甘油，10 (v/v)甘油，100 mM NaCl 0.5(v/v)TritonX-100]含有蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich)，然后使用PierceTM BCA蛋白检测试剂盒(Thermo FisherScience)进行定量。提取的总蛋白经10SDS-PAGE凝胶分离后，用免疫印迹PVDF膜(Bio-Rad)标记。用鼠抗GFP单克隆抗体(15,000; Roche)检测GUN1-GFP融合蛋白。
1.3光化学效率和最大叶绿素荧光的测定
根据仪器制造商的指示，创建了最大叶绿素荧光(FM)的图像，并用含有CCD摄像机和辐照系统的荧光凸轮系统(FC800-C/1010GFP;PhotonSystems Instrumentals)测定了光系统II(FV/FM)的最大光化学效率。
1.4细胞死亡的测定
将植物组织浸入TB染色液(10 g苯酚、10 ml甘油、10 ml乳酸、0.02 g台盼蓝、10 ml H2O)中，用乙醇12 (v/v)稀释，煮沸2 min。室温孵育16 h后，用250 g水合氯醛和100 mlH2O的脱色液去除非特异性染色。然后将植物组织保存在50 (v/v)甘油中进行成像。为了测定电解质渗漏，在指定的时间点采集第一片或第二片叶子，并将其转移到含有6 ml去离子水的15 ml试管中。室温培养6 h后，用Orion Star A212型导电仪(Thermo Science)测定溶液的电导率。每种方法各用6片叶片，重复3次。
在染色溶液中加入突变株叶片，在盖子上打孔。溶液(在通风柜中)煮沸2分钟。把管子拿出来放在通风柜里大概有一段时间。一小时。(4小时/摇晃)。倒出染色液，加入脱色液。改变了几次溶液(完全染色约。24-48小时，大约过后第一次更换脱色液。4小时)。倒掉去色液，加入50的甘油(在此溶液中保存4小时)，然后拍照。
1.5RNA提取和定量RT-PCR(qRT-PCR)
总RNA提取采用光谱植物总RNA试剂盒(Sigma-Aldrich)，分光度法测定波长为260 nm，采用Thermo FisherScience(Thermo Fisher Science)。根据制造商的建议，使用PrimeScriptTM RT试剂盒(Takara)反转录总RNA(1μg)。在QuantStudioTM6Flex实时荧光PCR系统(AppliedBiossystems)上，用iTaqUniversalSYBRGreen PCR主混合(Bio-Rad)进行定量RT-PCR。用DDCT方法计算相对转录水平，并与ACTIN2或UBQ10基因转录水平标准化。
1.6共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)
取转基因拟南芥叶片，制片，在Leica SP8荧光共聚焦显微镜下观察GFP荧光信号。
2 技术路线
3可行性分析
（1）实验室技术成熟，实验室关于拟南芥杂交和载体基因转入的技术非常成熟，有着大量关于拟南芥突变体筛选的技术方法。有助于我们成功构建出目标的纯合突变株。
（2）实验室相关设备材料齐全。实验室已经成功构建好了lsd1 glk1 glk2突变株，也常年保留了lsd1,gun1的种子。并且实验室也配备了充足的引物和抗体蛋白，可以方便地进行各种检测。
（3）指导老师经验丰富，Kim组长期研究植物叶绿体相关的各种信号通路，尤其是对LSD1、GUN1的研究很多。指导教师课题组实施本项目的相关实验技术成熟，设备齐全将为本项目的实施提供强大的后盾。4. 研究创新点
对于LSD1信号通路的研究已经较为成熟，但是对于GUN1信号通路的研究，目前各个实验室依旧没有好的成果。我们猜测LSD1和GUN1的信号通路之间存在相互影响，故将LSD1和GUN1的信号通路放在一起检测其相关基因的表达，对于研究GUN1的信号通路是一种新的思路。
5. 研究计划与进展
2018年7月-8月 ：
lsd1 gun1纯合突变株的筛选；
2018年9月-12月：
