1. 研究目的与意义
鱼类是脊椎动物中最原始且种属数量上最多又最占优势的类群，分布广泛，并拥有丰富的遗传多样性。
本世纪以来，随着现代分子生物学研究技术的不断发展，基于pcr和基因直接测序的分子数据已经被广泛应用于鱼类分类学、系统发育与进化分析和种群遗传学等方面。dna作为遗传物质，是物种进化最忠实的记载者。线粒体dna（mitochondrial dna，简称mtdna）结构较为简单，呈母系遗传，容易发生突变，进化速度快且不发生重组，现已成为一种被广泛应用的分子标记，其中的一些基因是系统发育研究的热点基因。
细胞色素氧化酶(cytochrome oxidase)由13个蛋白亚基构成，其中coⅠ、coⅡ、coⅢ三个亚基由mtdna编码，这三个基因进化速率适中，是种属系统发育研究的良好标记。同时，细胞色素氧化酶是生物氧化过程中电子传递链的重要组成部分，细胞色素氧化酶参与细胞色素c的电子传递反应，而细胞色素c的释放将会导致细胞凋亡的发生。因此，分析细胞色素氧化酶基因的序列保守性不仅有助于研究鱼类的系统发育情况，还对细胞凋亡的基础研究具有帮助。
2. 研究内容和预期目标
研究内容：
1、暗纹东方鲀mtdna的提取。
2、目的基因片段coⅠ的pcr扩增片段，鉴定，测序。
3. 研究的方法与步骤
一、采用酚-氯仿抽提法提取暗纹东方鲀mtDNA
实验步骤：
1、组织处理：将-80℃冻存的暗纹东方鲀肌肉组织置于冰上，用眼科剪快速剪取新鲜组织0.1-0.2g，置于研钵中，加入STE分离缓冲液1000-1200μL
，轻轻破碎组织，然后转入玻璃匀浆器中将组织进一步捣匀。将浸出液分装
置6个Eppendorf管(1.5ml)中，每管约200μL（注意尽量防止带入脂质）。
2、1000g离心5min后，将上清液倾倒于另外6个EP管中（注意尽量防止带入脂质）。然后，15000rpm离心10分钟，弃掉上清液保留沉淀，向沉淀中加入500μL STE分离缓冲液，轻轻吹打混匀，将每2管并入同一个EP管（这样有3管）。
3、12500rpm离心10min后，弃掉上清保留沉淀，吸干残留液体，向每个EP管中各加入800μL的STE分离缓冲液，小心地吹打混匀。
4、核酸酶降解。每管加入DNaseI Buffer 10μL，DNase I 0.5μL，RNase A 18-20μL，轻轻弹匀，静置于室温(20℃)下1h。
5、每管加入0.5mol/L EDTA 80μL，混匀后，12500rpm离心10min，弃掉残留液体，吸净管壁上的液体，保留沉淀。每管加NTE分离缓冲液450μL，0.5mol/L EDTA 10μL，混匀。
6、蛋白质变性与水解。每管加入10%SDS溶液30μL，混匀后，37℃水浴1h（直到溶液变得清亮透明）。每管加入10mg/ml蛋白酶K 20μL，混匀后，50℃水浴2-3h。
7、每管加入10%SDS溶液，混匀后37℃水浴1h（直到溶液变得清亮透明）。
8、酚/氯仿抽提。每管加入水饱和酚（下层为浅黄色）500μL，混匀，12000-13000rpm离心10min。小心地吸取上清液弃掉沉淀（注意尽量防止带入蛋白质），每管加入500μL氯仿，轻轻混匀后，13000rpm离心10min。然后，再次小心地吸取上清液，每管加入500μL氯仿，轻轻混匀后，12000rpm离心10min。
9、乙醇沉淀。小心地吸取上清液，每管加入1/10体积的3mol/L预冷的
NaAc
溶液(PH=4.8)。每管加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，轻轻吹打混匀沉淀。于-20℃静置1h。4℃15000rpm离心10min后，弃掉残留液体，可见底部有白色絮状沉淀。加入70%乙醇约(300-500μL)洗盐，15000rpm离心10min（此步操作重复一次）。
10、离心后弃掉液体，此时底部可见较多白色沉淀，自然晾干。
11、加入60μL TE缓冲液溶解。样品保存于4℃冰箱中。
12、于室温干燥，加入50L的无菌水，轻轻混匀，冷藏保存。取适量进行电泳鉴定。
二、目的基因COⅠ的同源克隆
（一）PCR克隆目的基因
1、从Genbank调取红鳍东方鲀COⅠ基因序列，设计上下游引物以备用于暗纹东方鲀的同源克隆。
2、构建PCR反应体系：
| 组分 | 含量（L） |
| 2× PCR 缓冲液
| 12.5 |
| 上游引物 | 1 |
| 下游引物 | 1 |
| 模板DNA | 2.5 |
| ddH2O
| 14 |
| 总体积 | 31 |
3、PCR反应程序：
| 过程 | 温度 | 时间 |
| 预变性 | 95℃ | 5min |
| 变性 | 95℃ | 30s |
| 退火 | 55℃ | 30s |
| 延伸 | 72℃ | 60s |
| 经35个循环 | ||
| 延伸 | 72℃ | 10min |
| 4℃保存 |
4、PCR扩增结束后，用移液枪取6L进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。若鉴定出目的扩增片段则进入下一步，否则重新扩增。
5、剩余25L体系在琼脂糖凝胶电泳分离后，用TaKaRa凝胶回收试剂盒割胶回收扩增片段。
（二）感受态细胞的制备
1、在超净工作台桌面上喷洒70%乙醇擦拭，后开紫外灯灭菌30min左右。
2、取两支无菌的摇菌试管，在无菌操作环境下，往试管中分别加入 3 ml不含抗菌素的 LB 培养基。
3、从冰箱中取出DH5菌种，放置在冰上。在超净工作台中用无菌枪头吸取 20L 菌液，加入到含有3ml LB 培养基的试管中，放入恒温摇床中，设置37℃，培养过夜。
4、用移液枪和无菌枪头取 1ml上述菌液移入含有 50ml LB 培养基的三角烧瓶中，放入恒温摇床中，设置 37℃，转速 250rpm，培养 3 个小时。
5、在无菌的操作环境下，将活化的菌液加入到 1.5 毫升的已预冷的离心管中，在冰上放置 10 min，然后放进台式冷冻离心机中，设置 4℃，转速5000rpm 下进行离心，时间为 10 min。
6、离心后去上清液，在保留沉淀的离心管中加入 1 毫升冰冷的 0.1 mol/LCaCl2 溶液后，立即颠倒混匀。将混匀后的溶液插入冰块中放置 30 分钟。之后放入台式冷冻离心机中，设置 4℃，转速 5000rpm 下进行离心，时间为 10 min。
7、去上清液后，用移液枪吸取 200μL 冰冷的0.1 mol/L CaCl2 溶液来重悬菌体。之后得到的感受态细胞可以直接用作转化实验或者加入甘油保存于-80℃冰箱。
（三）目的基因片段与载体的连接
取一个灭菌的 0.2 毫升离心管，在里面加入
| 组分 | 含量（L） |
| 10× Buffer | 1 |
| 50%PEG | 1 |
| pMD-T 载体 | 1 |
| DNA 回收产物 | 6 |
| T4 DNA Ligase（4U/vl） | 1 |
| 总体积 | 10 |
将混合液轻轻振荡后再短暂离心，然后放入温度为 16℃的恒温培养箱中，保温过夜。连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞，或放入 4℃冰箱备用。
（四）转化
1、将 LB 固体培养基放入恒温水浴锅中加热融化后，拿出，在室温下冷却至 50℃左右，在超净工作台上加入 200μL /100mL 的氨苄青霉素到 LB 培养基中，用已经高温蒸汽灭菌过的培养皿倒平板，倒好后静置。
2、取两支新鲜制备的感受态细胞置于冰上，然后用移液枪轻轻地将细胞均匀悬浮。
3、在感受态细胞中各加入 5L 连接液，轻轻混匀。
4、将其在冰上放置 30 分钟，每隔 10 分钟将其轻轻弹匀再放在冰上。
5、在恒温水浴锅中，温度 42℃下，水浴热激 90 秒。
6、在冰上放置 3 分钟。
7、然后在其中加入 800L 的 LB 培养基，在 37℃，转速 220rpm 的情况下扩培 1 小时。
8、将其放进台式离心机中，设置转速 4000rpm 进行离心，时间为 5 分钟。后用移液枪小心地去掉 900L 上清液，接着将细胞悬浮。
9、加入 40μL X-gal 和 7L IPTG 混匀。
10、全部混匀后用无菌枪头吸取溶液后，放置于培养皿中心，接着用玻璃涂布棒先在酒精灯上灭菌，冷却后将溶液均匀涂布在上述平板培养基上。
11、将涂布后的培养皿放入恒温培养箱中，设置 37℃，先正置 1 小时，然后再倒置培养过夜（约 15 小时）。
12、观察转化产物的涂布平板和培养后的结果，观察有无单克隆菌落。发现培养基上有蓝白斑的产生，选择周围无杂菌的白色单菌落进行挑斑。
（五）阳性克隆的筛选
1、在超净工作台上，在 3 支含有 3 毫升 LB 培养基的无菌试管中分别加入6L 氨苄青霉素（含 50g/mL 氨苄青霉素），用记号笔写好编号。
2、在超净工作台中，使用移液枪的无菌枪头尖部，轻轻挑起转化的平板培养基上的一个单独的、周围无杂菌的白色菌落，然后将枪头直接隔空打入盛有 3 毫升 LB 培养基（含 50g/mL 氨苄青霉素）的试管中。用这个方法随机选取3个周围无杂菌的、单独的白色菌落分别装入 3 个试管中。
3、将 3 支摇菌管塞好棉塞，用毛线和牛皮纸包扎捆绑在一个玻璃瓶中，并用棉花和报纸等固定住，将其放置于恒温摇床中，于 37℃，转速 220rpm 下摇菌扩培 6 个小时。
（六）质粒抽提与酶切鉴定
1、用质粒DNA小量试剂盒提取质粒
2、用双酶切鉴定阳性菌落
酶切体系的构建：
| 组分 | 含量（L） |
| 抽提的载体质粒 DNA | 8 |
| 10× 酶切buffer | 2 |
| HindⅢ | 0.5 |
| EcoRⅠ | 0.5 |
| ddH2O | 9 |
| 总体积 | 20 |
再放入台式离心机中以 1000rpm离心 10秒。取出后插到离心管架中，放入恒温水浴锅中，在 37℃下水浴 2个小时。之后将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
3、剩下的阳性菌落质粒DNA送到生物公司进行测序。
三、COⅠ,COⅡ,COⅢ基因的序列保守性分析
从Genbank调取若干种鲀科动物的COⅠ,COⅡ,COⅢ基因序列，结合已经测序得到的暗纹东方鲀的COⅠ基因序列，整理实验数据，用ClustalX，MEGA等软件对所测序列编辑、排序，并且采用Kimura双参数法模型计算遗传距离，构建系统树（NJ树）。
4. 参考文献
[1]刘丽, 刘楚吾, 张明辉, 等. 不同保存条件下鱼类组织基因组dna的提取效果分析[j]. 广东海洋大学学报, 2007, 27(6):19-22.
[2]肖武汉, 张亚平. 鱼类线粒体dna 的遗传与进化[j]. 水生生物学报, 2000, 24(4): 228-236.
[3]郭新红, 刘少军, 刘巧, 等. 鱼类线粒体dna 研究新进展[j]. 遗传学报, 2004 , 31(9) : 983- 1000.
5. 计划与进度安排
（1）2022-2022-1学期17-20周---2022-2022-2学期第1周(2022-3-11)：接受并阅读任务书。查阅资料，了解所选基因的基本情况，准备开题报告，外文论文翻译。制定试验计划与每日安排。
（2）2022-2022-2学期第2周---第4周(2022-3-12---4-1)：综合相关文献资料，撰写开题报告，原材料制备，完成实验前准备工作，配制各实验所需药品；学习提取鱼的基因组dna和扩增线粒体coi基因。学会使用pcr仪，对pcr反应体系，循环参数进行摸索和调整等措施；学会制胶，学会凝胶电泳与电泳染料成像技术，学习制备感受态细胞，pcr目的基因。
