微生物介导的O-甲基化双酚A的代谢物与毒性增加对斑马鱼胚胎的发育结果外文翻译资料

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微生物介导的O-甲基化双酚A的代谢物与毒性增加对斑马鱼胚胎的发育结果

Jessica M. McCormick, Theo Van Es, Keith R. Cooper, Lori A. White, and Max M. Haggblom*

新泽西州罗格斯州立大学生物化学和微生物学，环境学和生物科学，美国，新泽西州08901新不伦瑞克，76李普曼驱动器。

摘要: 双酚A（BPA）是被用在塑料的制造中的，并且已经确定包括在人的血清和母乳的各种环境矩阵下。暴露于人类的环境和潜在的BPA的患病率中，强调需要更充分地理解归趋BPA在环境中对人体和其他生物的毒性而由此产生的影响。在这里我们说明的是，结核分枝杆菌，包括vanbaalenii分枝杆菌菌株PYR-1，能够O-甲基化双酚A的单-和二甲醚衍生物（分别是BPA MME和双酚A二甲醚）。O-甲基化双酚A的结果与增加毒性代谢产物如图所示，暴露在BPA斑马鱼胚胎从发育到存活和发育发生病变的差异。暴露在BPA ，BPA MME和BPA DME中的斑马鱼胚胎从发育到存活和发育发生病变的差异。

单和二甲醚衍生物比双酚A的毒性，导致在死亡率上升在5 ( LC50 = 0.66 到1.2 mg L^-1)和28 (LC50 = 0.38,lt;0.5 mg L^_1) 天受精后。此外，将暴露于O-甲基化双酚A的代谢物导致增加的发育性病变发生率与暴露于BPA相比。这些数据说明了微生物的新机制、BPA的转化和代谢物生产进一步的研究，以了解再这环境中它们的患病率和效果。

介绍

由于在聚碳酸酯塑料，牙齿填塞物，供水管和环氧树脂中的大量使用，双酚A [BPA，2,2—二（4-羟基苯基）丙烷] 对人类潜在的风险已成为一个主要的问题。BPA在由环氧树脂制成的金属罐,奶瓶,食品容器,可重复使用的水瓶中大量使用而进入了公众的视野。在美国每年生产双酚A所花费的价值大概有23亿英镑。有趣的是,环境中的BPA也可以来源于四溴双酚A(TBBPA)灭火剂中微生物在厌氧环境中的还原脱卤作用。对BPA样品的各种检测结果令人担忧,因为双酚A是一种已知的内分泌干扰物,它主要是通过影响细胞核激素受体来对人体施加影响。

金属罐内的环氧树脂衬的浸出结果表明，影响人体的BPA主要是从使用的瓶子和其他塑料的一次性食品容器中摄入。对人类初乳的分析得知了每毫升血液中BPA的浓度。由于在生产过程中的释放，BPA也被发现在尘土样品,和大气样品中。环境中的BPA被发现在制造业工厂排放的污水，垃圾填埋场渗滤液,污水废水中。环境中的BPA的浓度从0.5到5400mu;g/L^-1。BPA的患病率和潜在性凸显人类了需要更充分地理解环境中双酚A的转化和对人类与其他生物产生的毒性作用。

微生物在BPA的降解中起着重要的作用。BPA可以在好氧条件下被多种微生物无机转化为CO2。并不是所有微生物行都可以完成该反应；对于许多酚类化合物来说一个重要的转化反应是O-甲基化转型。甲基化的一种常规反应表现为供体的甲基转移，如S-腺苷甲硫氨酸（SAM）中脱除一个氧原子。这种转变已经在动物，真菌，植物，细菌和几种酚类化合物中被发现。这项研究首次证明微生物影响会影响BPA，包括一甲基(BPA MME)和二甲醚(BPA DME)在有氧条件下由多种分枝杆菌参与的的O-甲基化。此外，我们的研究表明BPA的转化后的产物对于斑马鱼胚胎的毒性强于对其母体的影响。我们的数据还不能证实BPA发生该反应所需要的条件，还需要进一步研究。

图1.分枝杆菌菌株vanbaalenii PYR-1 BPA的O-甲基。样品的气相色谱零之后拍摄，一到两个星期孵育100mu;M的BPA显示在13.77分钟，并确定为BPA MME两种代谢的保留时间BPA在13.39分钟，和BPA二甲醚在13.0分钟。三溴苯酚用作在10.17分钟洗脱的内标物。类似的结果发现M. chlorophenolicum，偶发分枝和M.耻垢（未示出）。

实验方法

化学品：双酚A（BPA，4,4-二羟基-2,2-二苯基丙烷，CAS# 80_05_7），从Sigma Aldrich公司获得（gt;98％纯度）。从Acros获得的双酚A二甲醚（DME BPA，4,40-异亚丙基二甲醚，CAS# 1568_83_8），通过GC-MS分析的 gt;99%纯度）。合成O-甲基衍生物，双酚A是在过量的甲基碘和钾的回流并经过一夜的碳酸盐缓冲液。将得到的混合物为约50％双酚A的MME（4-羟基40甲氧基-2,2-二苯基丙烷）和50％的双酚A二甲醚（由气相色谱 - 质谱分析法，GC-MS），和剩余BPA的量踪（数据未显示）。然后将反应产物蒸发至干，并溶解于苯。BPA MME和BPA DME由第一洗脱BPADME在硅胶柱上纯化100％的苯，接着用5〜10％丙酮的苯洗脱BPA MME。收集的级分，蒸发至干并通过薄层色谱法纯度筛选。在BPA二甲醚的级分弃去含有MME-BPA的级分合并通过GC-MS分析，证实纯度（gt;99％）。

细菌菌株和生长培养基：结核分枝vanbaalenii应变PYR-125由卡尔博士Cerniglia获得（美国国家毒理学研究中心、食品和药品监督管理局）。于28℃脑心浸液中培养（BHI）以60rpm振荡。结核分枝杆菌chlorophenolicum品种PCP-1和偶发分枝杆菌CG-227是在28℃R2A肉汤中生长，并以60rpm振荡。当需要隔离的菌落时，在28℃下，R2A（Difco）中的琼脂平板上培养生长。耻垢分枝杆菌菌株mc2155，从南希康奈尔博士（新泽西医学与牙科大学 - 新泽西医学院）获得，在37℃下并补充有白蛋白，葡萄糖和氯化钠的米德尔生长7H9（Difco）肉汤中以100rpm摇动。

斑马鱼菌株的养殖：将斑马鱼的AB品种鱼（Danio rerio）用于所有实验中，以及从斑马鱼国际资源中心（ZIRC）得到的斑马鱼，老化3个月至1年，以28℃饲养维持在再循环水栖息系统中，再利用光：暗的周期14H:10H。所有实验进行均根据由罗格斯大学动物和设施委员会批准的方案保养施行。

分枝杆菌的O-甲基化双酚A：M. vanbaalenii PYR-1，M CG2偶发，M chlorophenolicumPCP-1和耻垢分枝杆菌155接种到5mL脑心脏浸液肉汤（BHI）中，并在28℃生长，通风48小时。一旦培养物达到0.6的OD₆₈₀，按1:10稀释，并在28℃生长至1.0 OD₆₈₀。一式三份制备实验中，培养中的一个毫升的接种到用聚四氟乙烯盖衬垫7毫升无菌玻璃小瓶中的，骤然升高到100mu;M的BPA。为了测试O-甲基化双酚A是否是诱导型或组成型表达，培养预生长在BHI使用或者不使用100mu;L的1毫克毫升孵育，1氯霉素去抑制蛋白质的合成。三份培养在室温下振荡温育。于0，1，3，6，8，9，和14天，每条件一个小玻璃瓶，20℃下贮存，再进一步处理。将样品解冻，然后酸化，用盐酸和20mu;M的2,4,6-三溴苯酚的加入作为内标进行萃取用1mL己烷一小时。除去己烷相并通过GC-MS分析。

图2.双酚A的质谱和两个代谢物，双酚A的MME和BPA二甲醚的228，242，和256中的M / Z对应于各分子离子。所有光谱表明的M-15的典型碎片。

分析方法：通过GC-MS分析，使用Agilent进行系列6890气相色谱仪和质量选择一个5973N检测器并配有一个不分流进样器和一个HP-5MS柱（30m长times;0.25毫米直径的times;0.25mu;m内径）。注射器温度为250℃下用的注射体积为1mu;L，烘箱温度程序开始在70℃，倾斜15℃min^-1至300 ℃，并保持5分钟。对操作鉴定代谢产物的质量选择检测器是在全扫描模式（32到600m/ z）。选择的离子检测（SIM）是用于检测和量化的BPA（213和228mz^-1），BPA MME（227和241 mz^-1）和BPA DME（241和256mz^-1）。

斑马鱼胚胎的收集和治疗：斑马鱼胚胎在大约3小时后受精，收集（HPF）和暴露在4mL玻璃小瓶的BPA（1，2.5，5，10，和2mg/ L ^-1），双酚A的MME（0.25，0.5，1，2.5和5mg /L ^-1），双酚A二甲醚（0.5，12.5，5和10mg/L ^-1）或二甲亚砜（0.15％），作为媒介控制，在无菌水中。而非媒介被列入控制，以确认该二甲基亚砜使用浓度对斑马鱼发育没有影响。一个静态的，使用非重建方略。实验剂量分别为后初步剂量反应研究，以获得所确定的初期步骤的斑马鱼的研究中的最佳剂量曝光和浓度类。每个胚胎放入各个小瓶中并观察168小时。研究用每个剂量25个胚和所有的研究进行均重复至少三次。发展的病变，包括水肿和出血，以及孵化的死亡和日期，每天记录。 7天后，将幼体从瓶中取出并放置到来自斑马鱼含有水的和煮小麦种子的水生系统。在接下啦的21天中，在AP100（水生环境）中喂食草履虫培养。28天受精后（DPF）统计所有剩余的活幼体和利用三卡因过量甲烷磺酸盐（MS-222，Sigma）安乐死的幼体并计数。LC50，如所描述。这是剂量需要引起死亡率在测试50％的数量，并用概率单位法确定的标准误差。

统计分析：确定数据的正常性用sigema统计版本10.1，Mann_Whitney检验用于检查孵化数据被用于功率和相应的统计检验。用卡方分析对于病变和死亡数据。P le;0.05是作为所有数据中最有重要意义的。

结果

O-甲基化双酚A：要确定是否微生物可以用O-甲基化双酚A，我们利用众所周知的O型甲醇等羟基化芳香族化合物分枝杆菌菌株，如多环芳烃，2,4,6-三溴苯酚和四溴双酚A（TBBPA）。通过质谱如单标识醚（BPA MME）和二甲醚（BPA DME）（图2），M. vanbaalenii PYR1与100mu;MBPA培养产生了两个新的代谢物（图1）。

表1.由结核杆菌BPA氧甲基化的比较种类 ¹

1. 对数期培养物在28℃中BPA的存在下孵育，样品被采取在一周和两周中酸化，并用萃取己烷通过GC-MS分析为单和BPA代谢物。代谢物浓度的双酚用百分比转换。

通过监控BPA O-甲基化的速度和程度，晚对数相（OD =1.0）的分枝杆菌菌株培养PYR-1，PCP-1，CG-2，和155被暴露至100mu;MBPA和用于分析生产单和二甲醚的代谢产物。以不同的速率和不同程度（表1）测试所有分枝杆菌菌株能够O型甲醇双酚A。 M.vanbaalenii PYR1和M. chlorophenolicum PCP1转换双酚A大约为10％，BPA MME小于1％，双酚A二甲醚超过两周潜伏期（表1）。

为了测试O-甲基化是否是诱导或组成表示转型，M培养的vanbaalenii PYR-1预生长于BHI（无需事先接触到BPA）被掺入BPA，有或没有氯霉素抑制蛋白合成。 BPA转型与文化的速率或无氯霉素接近相等，9天后导致5〜7％BPA转化为 BPA MME和BPA DME（图3）。这些数据表明在M. vanbaalenii PYR-1组成性表达中，O-甲基化负责BPA到BPA MME转型BPA DME。

双酚A，双酚A MME和BPA二甲醚对斑马鱼胚胎发育的相对毒性：为了评价BPA的相对毒性和其转化产物，将斑马鱼胚胎发育暴露于BPA，双酚AMME，和BPA DME中并测试存货和发育的病变差异。，双酚A，双酚A MME和BPA DME对于LC50的值在5到28 dpf的死亡百分率进行了测定，对这些化合物增加了毒性程度顺序。选择这些时间点，因为它们代表了胚胎期（短期生存）和幼体期（长期存活）。在5 dpf的BPAMME是最有效的，其次是双酚A二甲醚和由双酚A（表2）。与此相反，在28dpf，BPAMME和BPA DME也有类似的LC50值，但我们认为BPA DMA更有毒，因为百分比在28 DPF的死亡率是那些暴露在BPA二甲醚高。因此，斑马鱼发育的时期BPA-DME是更有效的，而在胚胎斑马鱼时期（表2）BPA MME比双酚A在更有毒性。

图3.由M. vanbaalenii PYR1 BPA的O-甲基化。 M. vanbaalenii应变PYR-1在28℃单独孵育与100mu;M的BPA和用1mg ml^-1氯霉素抑制蛋白质合成。样本接管9天，的对BPA单和二甲醚的代谢物通过GC-MS提取和分析检测。实验一式三份进行，并重复三次以上。

观察到最低有害作用剂量（LOAEL，与需要控制的剂量检测相比发生显著发育畸形）来排列的化合物的毒性以及指示曝光的水平在哪些发展是受到影响。有害作用剂量比双酚A的MME和BPA二甲醚比BPA暴露的动物（表2）低。再次，这些数据说明BPA的O-甲基化代谢物是比BPA更具毒性。

暴露于双酚A，双酚AMME，或BPA DME的斑马鱼的死亡率：暴露的BPA DME比BPA更有毒性，导致暴露于4dpf,2.5，5，或10mg/L（图4C）有100％的死亡率在。 BPA MME也更比BPA毒性，导致暴露于5mg/L，2dpf和2.5mg

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