中国药科大学本科生毕业论文（设计）开题报告
课题名称 Dmrt5、Fam49b基因过表达对小鼠胚胎干细胞分化的影响
课题性质 基础研究 ✔️ 应用课题 设计型 调研综述 理论研究
开题报告内容：
拟研究问题：Dmrt5、Fam49b基因过表达对小鼠胚胎干细胞分化的影响
根据之前的实验研究以及文献参考发现，Dmrt5作为一种转录调控因子控制着腹侧中脑神经元前体和中脑多巴胺神经元命运的决定。可以引起Dmrt4、Ngn2、 Ebf2、Ncam的上调,这些基因都是嗅觉神经分化的分子标记,因此Dmrt5是一个参与爪蟾嗅觉神经分化的重要的潜在的因子。通过实验”动物帽”半定量PCR的方法验证，Dmrt5的过表达在离体条件下可以诱导嗅觉神经的形成。而基因Fam49b的功能与细胞增殖和细胞凋亡有关。通过使用CRISPR/Cas9技术构建Fam49b基因敲除人类细胞系,运用基因功能缺失策略来研究Fam49b基因功能。结果显示，Fam49b敲低后,细胞周期和细胞调亡均无明显变化,而细胞生长速度却明显下降，说明Fam49b的缺失可能抑制细胞的增殖能为。通过对这两种基因功能的初步了解，我们采用已经用慢病毒侵染成功的分别携带这两种基因的小鼠胚胎干细胞，使其在不同培养条件下，分别过表达，并设置不过表达的实验组作对照，观察胚胎干细胞干性维持情况以及分化情况。
胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团或桑葚胚分离出来能在体外长期培养的高度未分化的全能细胞系，具有高度的发育潜能和分化潜能。胚胎干细胞可以在体外无限扩增，在体外适宜条件下，如在饲养层上或含有分化抑制因子的培养基中，胚胎干细胞可以稳定传代，长期培养，保持高度未分化状态和发育多潜能性。并且，胚胎干细胞具有可操作性，例如用同源重组的方法插入(或删去)某个基因，诱导基因突变，或导入额外的原有基因使之过度表达等。理论上，胚胎干细胞经遗传操作选择后一般仍能保持其扩增和发育的全能性或多能性，因此可以通过遗传操作选择生产转基因动物或基因有缺失、突变或过量表达的杂合或纯合个体进行各种基因功能分析。胚胎干细胞在体外培养的过程中，可以对其冻存，并且冻存的细胞可以随时解冻，继续培养而不失其原有特性。根据胚胎干细胞的以上特征，将它作为本次实验的研究对象。
实验过程，首先复苏冻存的小鼠成纤维细胞，传至P3代时，用丝裂霉素c处理，制成饲养层细胞并及时冻存。在接种小鼠胚胎干细胞的前一天将饲养层细胞复苏并接种入预先用0.1%明胶溶液包被的细胞培养板内，置于37℃，5％CO^2培养箱培养过夜，可以得到密度合适的饲养层细胞单层。将Dmrt5、Fam49b细胞株复苏，接种于铺有新鲜饲养层细胞的培养板内，于37℃，5％CO^2培养箱培养、扩增。当细胞生长到密度适宜后，一组培养在饲养层细胞上，添加药物使侵染的基因过表达，观察其对细胞干性的影响，并设置未用药物处理过的实验组进行对照。另一组干细胞直接贴壁培养，添加药物使基因过表达。Dmrt5实验组观察其是否诱导细胞向神经元方向分化；Fam49b实验组观察其对细胞生长的影响，也同样设置基因没有过表达的实验组做对照。
