在三维自组装肽水凝胶中控制亚纳米表位间距外文翻译资料

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Controlled Epitope Spacing in a Three-Dimensional Self-Assembled Peptide Hydrogel

1. Thomas Pashuck,^{dagger;,Dagger;,sect;} Benoicirc;t J.R. Duchet,^Dagger; Catherine S. Hansel,^{dagger;,Dagger;,sect;,} Stephanie A. Maynard,^{dagger;,Dagger;,sect;} Lesley W. Chow,^{dagger;,Dagger;,sect;,} and Molly M. Stevens*^{,dagger;,Dagger;,sect;}

^dagger;Department of Materials, ^Dagger;Department of Bioengineering, ^sect;Institute of Biomedical Engineering, and Department of Chemistry, Imperial College London, London SW7 2AZ, United Kingdom

*S Supporting Information

ABSTRACT: Cells in the body use a variety of mechanisms to ensure the specificity and efficacy of signal transduction. One way that this is achieved is through tight spatial control over the position of different proteins , signaling sequences, and biomolecules within and around cells. For instance, the extracellular matrix protein fibronectin presents RGDS and PHSRN sequences that synergistically bind the alpha;₅beta;₁ integrin when separated by 3.2 nm but are unable to bind when this distance is gt;5.5 nm.¹ Building biomaterials to controllably space different epitopes with subnanometer accuracy in a three-dimensional (3D) hydrogel is challenging. Here, we synthesized peptides that self-assemble into nanofiber hydrogels utilizing the beta;-sheet motif, which has a known regular spacing along the peptide backbone. By modifying specific locations along the peptide, we are able to controllably space different epitopes with subnanometer accuracy at distances from 0.7 nm to over 6 nm, which is within the size range of many protein clusters. Endothelial cells encapsulated within hydrogels displaying RGDS and PHSRN in the native 3.2 nm spacing showed a significant upregulation in the expression of the alpha 5 integrin subunit compared to those in hydrogels with a 6.2 nm spacing, demonstrating the physiological relevance of the spacing. Furthermore, after 24 h the cells in hydrogels with the 3.2 nm spacing appeared to be more spread with increased staining for the alpha;₅beta;₁ integrin. This self-assembling peptide system can controllably space multiple epitopes with subnanometer accuracy, demonstrating an exciting platform to study the effects of ligand density and location on cells within a synthetic 3D environment.

KEYWORDS: self-assembly, peptides, cellminus;material interactions, hydrogels, integrins, fibronectin, synergy sequence

Materials designed for regenerative therapies often try to recreate the native or developmental environment that surrounds cells in vivo.² Mimicking factors that

are important in controlling the behavior of specific cell types is difficult as cells can detect differences in temporal and spatial expression of proteins and other biomolecules.³ An area of increasing importance is the physical location of various proteins and bioactive groups in the cell, on the cell surface, and in the extracellular matrix.⁴ The physical spacing of bioactivity is accomplished through a variety of mechanisms including lipid raft domains⁵ on the cell surface that sequester specific proteins,⁶ scaffold proteins that bind and organize multiple proteins,⁶ and large proteins having several spatially arranged binding domains.⁷ The ability to utilize different combinations of proteins allows for increased signal fidelity and increases the possible signaling permutations with a smaller set of proteins.^8,9

The extracellular matrix (ECM) that surrounds cells contains a multitude of biomolecules that assemble into a complex network that provides mechanical support for cells and tissue-specific signaling moieties.¹⁰ One of these proteins, fibronectin, contains a variety of spatially organized bioactive sequences,¹¹ including an RGDS loop and a PHSRN “synergy sequence” that are separated by 3.2 nm.¹ These two peptide sequences simultaneously bind the alpha;₅beta;₁ integrin, and their spacing within the fibronectin is stabilized through beta;-sheets in fibronectin,¹¹ The activation of the alpha;₅beta;₁ integrin depends on the distance between the RGDS and PHSRN sequences, with distances gt;5.5 nm greatly reducing the ability to simultaneously bind the integrin.¹ Materials incorporating the RGDS and PHSRN epitopes have largely relied on random mixtures of the two

Received: September 4, 2016

Accepted: November 27, 2016

Published: November 27, 2016

Figure 1. (A) An alternating hydrophobicminus;hydrophilic peptide sequences form a bilayer with the hydrophobic amino acids on the interior.

1. The regular geometry of the peptide backbone allows for controlled subnanometer spacings between site-specific modifications of the PHSRN and cyclic RGDS peptides. Peptides with 0.7, 3.5, and 6.2 nm spacings were designated as “near”, “correct”, and “far”, respectively.
2. Unfunctionalized beta;-sheet peptides, denoted as the “backbone” peptides, were mixed with 2% functionalized peptides that form 3D hydrogels.

epitopes with mixed results.^12,13 Polyglycine spacers and fibronectin fragments have also been utilized in attempts to control the distance between the epitopes. It has also been shown that the al

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在三维自组装肽水凝胶中控制亚纳米表位间距

摘要：人体内的细胞使用各种机制来确保信号转导的特异性和有效性。实现这一目标的一种方式是通过对细胞内和细胞周围的不同蛋白质，信号序列和生物分子的位置进行严格的空间控制。例如，细胞外基质蛋白纤维连接蛋白呈现RGDS和PHSRN序列，它们在分离3.2nm时协同结合alpha;5beta;1整联蛋白，但当该距离gt; 5.5nm时不能结合.1构建生物材料以可控制地间隔不同的表位，具有亚纳米级精度三维（3D）水凝胶具有挑战性。在这里，我们合成了利用beta;折叠基序自组装成纳米纤维水凝胶的肽，沿着肽主链具有已知的规则间距。通过修饰肽的特定位置，我们能够在0.7 nm到6 nm以上的范围内，以亚毫米级的精度可控地间隔不同的表位，这在大多数蛋白质簇的大小范围内。包裹在呈现天然3.2nm间距的RGDS和PHSRN的水凝胶内的内皮细胞显示alpha;5整联蛋白亚基的表达与具有6.2nm间隔的水凝胶相比显着上调，表明间距的生理相关性。此外，在24小时后，具有3.2nm间距的水凝胶中的细胞似乎更多地扩散，并且alpha;5beta;1整联蛋白的染色增加。这种自组装肽系统能够以亚纳米级精度可控制地分隔多个表位，展示了一个令人兴奋的平台，用于研究合成3D环境中配体密度和位置对细胞的影响。

关键词：自组装，多肽，细胞 - 材料相互作用，水凝胶，整联蛋白，纤连蛋白，协同作用序列

为再生治疗设计的材料通常试图重建体内细胞周围的原生或发育环境.模拟因子在控制特定细胞类型的行为中是重要的，因为细胞可以检测蛋白质和其他生物分子的时间和空间表达上的差异。 一个越来越重要的领域是细胞内，细胞表面和细胞外基质中各种蛋白质和生物活性基团的物理位置。生物活性的物理间隔通过多种机制完成，包括细胞表面上的脂筏结构域它可以分离特定的蛋白质，可以结合并组织多种蛋白质的种蛋白质，以及具有几种空间排列的结合结构域的大蛋白质。利用不同蛋白质组合的能力可以提高信号保真度并增加可能的信号排列。

围绕细胞的细胞外基质（ECM）含有大量的生物分子，这些生物分子组装成复杂的网络，为细胞和组织特异性信号部分提供机械支持。其中一种蛋白纤连蛋白包含多种空间组织的生物活性序列，包括一个RGDS环和一个PHSRN“协同序列”，它们相距3.2nm。这两个肽序列同时结合alpha;5beta;1整联蛋白，并且它们在纤连蛋白内的间隔通过纤连蛋白中的beta;-折叠稳定化.alpha;5beta;1整联蛋白的活化取决于RGDS和PHSRN序列之间的距离，距离gt; 5.5 nm，大大降低了同时结合整合素的能力。掺入RGDS和PHSRN表位的材料在很大程度上依赖于两个表位的随机混合物，并且具有混合结果。聚甘氨酸间隔物和纤连蛋白片段也被用于试图控制表位之间的距离。也已经表明，RGDS和PHSRN之间的交替的丝氨酸 - 甘氨酸间隔序列导致比单独的丝氨酸或甘氨酸间隔物更强的alpha;5beta;1整联蛋白结合。尽管这些系统已经获得了对协同序列性质，整联蛋白特异性和显示支持细胞活力的能力，它们通常用作二维底物。

控制合成三维（3D）生物材料中生物活性基团的间距是具有挑战性的，因为细胞采用的大多数方法难以在体外可控制地再生。已经使用多种机制从分子构建块DNA纳米技术中控制官能团在两个维度上的间隔。然而，我们可以从大自然中汲取灵感，并利用具有规则和特征结构的beta;折叠图案。 beta;-折叠已经在肽自组装领域中被大量使用以产生可注射的水凝胶，可以包封细胞并且容易用生物表位或官能团修饰。交替的亲水疏水序列已被广泛用于诱导肽自组装成高纵横比的纳米结构。 Zhang实验室开发了交替荷电疏水肽。该交替基序已经与发夹肽一起使用以形成水凝胶，其已经被用于将细胞包封到剪切变薄的可注射水凝胶中。这些beta;-折叠片也可以用完全对照在氨基酸序列上，在肽的任何点提供各种可能的修饰。在这项工作中，我们利用这种策略可控地将环状RGDS和PHSRN表位置于沿着beta;-折叠肽的不同位置，其自组装成形成水凝胶的纳米纤维。当这些表位以纤连蛋白中发现的正确协同作用间隔（相距3.2nm）间隔时，与间隔6.2nm相比，存在alpha;5和beta;1整联蛋白基因的上调。显微镜检查也表明细胞扩散增加，并增加了alpha;5beta;1整合素的染色。这表明beta;折叠基序是一种有效的方式来控制多个生物活性表位并通过空间定向改善合成水凝胶的生物活性。

结果与讨论

可控表位间距肽肽水凝胶的设计。肽自组装是一个深入研究的领域，通常使用beta;-折叠二级结构来诱导短肽组装成能够形成水凝胶的一维纳米结构。然而，纳米结构内beta;折叠的确切排列可以有很大差异，我们试图设计一个系统，其中任何特定氨基酸侧基的位置可以先验知道。基于Hartgerink实验室的先前工作，我们选择了多域肽的修饰形式作为模型系统。这些肽具有交替的亲水 - 疏水氨基酸序列，其侧翼是带电荷的残基，其自组装成beta;折叠双层，如图1A。在我们的系统中，我们利用了一个交替的苏氨酸 - 缬氨酸序列，因为缬氨酸和苏氨酸都具有很高的倾向以形成负电荷的beta;折叠。谷氨酸在该序列的任一端。这些羧化氨基酸允许通过添加阳离子电荷中和肽，在这种情况下为Ca 2 ，并且其具有减少库仑相互作用和帮助在疏水性两侧上的两个面向内的谷氨酸之间形成钙桥的双重作用域。这些自组装肽形成长而扭曲的一维纳米纤维，纳米纤维内部的缬氨酸的疏水氨基酸侧基和暴露于外部的亲水性氨基酸（苏氨酸），在本文中称为“主链”肽。 beta;-折叠中相邻残基之间的轴向距离为0.35nm，并且氨基酸侧链从它们所投射的beta;-折叠的平面的哪侧交替排列。因此，在图1所示的beta;-折叠排列中，每隔一个氨基酸都会投射到beta;-折叠的同一侧，这将使每个侧链间隔大约0.7nm。由于这些肽是通过固相肽合成合成的，因此可以完全控制肽序列，并且可以在肽骨架上的任何点放置特定的氨基酸或官能团。这些结构具有形成双层的交替的亲水 - 疏水肽，并且有充分证据表明亲水性氨基酸位于纳米结构的外部，所以对这些亲水性氨基酸进行的任何修饰都应显示在纳米结构的表面上。在这项工作中，我们感兴趣的是模仿细胞外基质蛋白纤连蛋白上发现的协同作用序列，其中RGDS肽环位于距PHSRN肽序列约3.2nm处。根据计算机模拟，这些序列在3.2nm距离处同时结合alpha;5beta;1整联蛋白，但应该不能在5.5nm距离处结合。

合成复杂的多肽可能在技术上具有挑战性，在这项工作中，我们开发了一种优化的固相肽合成路线，详见支持信息。这利用了假脯氨酸残基，它有助于抑制合成过程中的聚集，以及2-氯三苯甲基氯固相树脂，它允许肽在温和的酸性条件下与假脯氨酸完整地从树脂上裂解下来，这有助于纯化肽。随后，我们使用点击化学将环状RGDS表位添加至自组装肽上存在的叠氮基 - 赖氨酸残基。这使我们能够创建一系列具有环状RGDS和PHSRN表位的肽系统，其间距为0.7,3.5或6.2 nm，如图1B所示。对于0.7nm的间距，这些肽标记为“接近”，对于3.5nm的间隔标记为“正确”，对于6.2nm的间隔标记为“远”。还研究了仅具有PHSRN或仅具有环状RGDS和骨架的对照肽。将这些官能化的肽与缺乏官能团的主链肽混合以形成98mol％主链和2mol％官能化肽的纳米纤维，如图1C所示。选择该比例是为了减少两种功能化肽沿着纳米纤维的长度彼此靠近的机会。 beta;-折叠中肽之间的距离约为0.5 nm，因此在2 mol％时，功能化肽彼此的平均距离应为25 nm，这是足够的距离，以确保两个肽通常不会在3.5 nm之内彼此的。然而，水凝胶中RGD粘附配体的密度在生物学上可能是重要的，并且我们已经优化了我们的系统以研究协同作用间隔对细胞粘附和整联蛋白表达的影响。这些自组装纳米纤维以10mM浓度在水中形成水凝胶，并且水凝胶通过加入中和肽的负电荷的二价阳离子如Ca 2 而被加强。这些水凝胶完全由肽组成，并且可以在细胞存在下凝胶化。

自组装纳米纤维的电子显微镜。电子显微镜在自组装肽上进行，并显示它们自组装成长而扭曲的纳米纤维，形成三维网络。骨架肽负责系统的自组装，并且各种功能化的肽在修饰的凝胶中仅包含2mol％的肽，因此预期跨样品的形态学将是相似的。

通过扫描电子显微镜（SEM），单独具有主链的凝胶（图2A）和正确的肽（图2B）形成了类似的纳米纤维的3D网络，表明在2％的肽上存在RGDS和PHSRN表位在网络结构上几乎没有影响。值得注意的是，由这些自组装肽形成的纳米纤维网络类似于体内环绕细胞的ECM的形态。因此该系统模拟生物活性肽序列的受控放置和天然ECM的形态。其他标记的肽的进一步SEM显示凝胶之间没有明显的差异（图S1）。在纤维上进行的透射电子显微镜（TEM）提供了它们的纳米结构的更好的视图。如图2C所示，骨架肽形成约4-6nm宽的扭曲纳米带，类似于之前已报道的具有类似结构27和约20nm间距的纳米带。对于包含2％具有正确间距的肽（图2D）以及所有其他肽系统（图S2）的纳米纤维，可见类似的形态。鉴于这些自组装纳米结构的尺寸与扭曲的beta;-折叠双层一致，有充分证据表明肽beta;-折叠的亲水侧上的官能团暴露在纳米纤维表面上。

水凝胶的光谱和力学表征。我们使用圆二色谱（CD）研究了水凝胶中的肽二级结构，这表明所有肽都形成beta;-折叠（图3A）。 CD光谱的最大值和最小值在样品间是相似的，表明水凝胶中的beta;-折叠具有类似的沿着beta;-折叠长度的扭曲和变形量。流变学用于研究肽水凝胶（图3B-C），并且有趣地显示，骨架肽可以在水中以10mM形成水凝胶，而没有任何添加的凝胶剂，具有约300-400Pa的储能模量（图S3）。加入20mM CaCl 2使凝胶变得明显更硬，具有超过1kPa的储能模量，各种水凝胶的机械性能之间几乎没有差异。这些水凝胶都具有基本上不受频率扫描中振荡应变频率影响的机械性能（图3B），并且在应变扫描中保持其大部分机械性能达到5％应变（图3C）。使用小百分比的肽功能化的系统的一个益处是水凝胶的机械性质可以独立于生物活性表位而被优化。研究表明，自组装肽水凝胶的硬度可以通过选择具有更强或更弱的形成beta;-折叠的氨基酸来调节，并且这些剪切变稀的水凝胶可以在注射的水凝胶中以非侵入方式递送，并具有最小的细胞活力丧失。

细胞对水凝胶中间距的响应。为了更好地理解间隔RGDS和PHSRN表位的生物学意义，我们使用人脐静脉内皮细胞（HUVEC），其表达alpha;5beta;1整联蛋白。将40,000个HUVEC接种在40mu;L10mM水凝胶中，并且在24小时内监测它们的扩散行为。接种四小时后，凝胶中的细胞尚未响应于扩散。RGDS和PHSRN之间的不同间距，尽管在正确的条件下看到了一些扩散（图4）。

到8小时，远处的水凝胶中出现了一些片状伪足，与正确的和接近的水凝胶相比，远处的水凝胶具有更少的凝胶。到24小时，正确的水凝胶中的大多数细胞都有可见的扩散，在近远系统中明显更少。钙黄绿素和乙锭同二聚体染色表明大多数细胞在所有时间点均存活（图S4）。骨架，RGDS和PHSRN水凝胶中的细胞染色全都显示出比协同凝胶显着更少的扩散，并且似乎证明细胞活力的总体降低（图S5和S6）。

在每个时间点对样品进行聚合酶链式反应（PCR）以确定表位间隔对不同整联蛋白亚基的基因表达的影响。为此，选择了三种基因：alpha;5亚基，beta;1亚基和alpha;v亚基，其是体内内皮细胞的另一主要alpha;整联蛋白亚基。 alpha;5蛋白仅与beta;1亚基形成二聚体，而beta;1整合蛋白与alpha;亚基更加混杂。 HUVEC也表达alpha;Vbeta;3整联蛋白对，其结合纤连蛋白但不协同结合RGDS和PHSRN表位并且对其间距不敏感。

在水凝胶中4小时后，在正确的水凝胶中alpha;5亚基的表达显着高于远端，RGDS或PHSRN，并且也高于近端和主链凝胶，尽管差异不显着（图5）。正确的凝胶也具有beta;1亚基基因的最高表达，对近端和RGDS水凝胶具有重要意义。在4小时时，没有凝胶在alpha;V亚基的表达中具有统计学显着差异。在8小时和24小时进行的PCR在正确的凝胶中alpha;5整联蛋白亚基表达与其他条件（图S7和图8）相比没有统计学显着的增加。

在水凝胶上进行的免疫细胞化学能够更好地观察不同微环境中的alpha;5beta;1整联蛋白。 24小时后，具有正确协同作用间距（图6B）的水凝胶中培养的HUVEC与其他条件（图6）相比，alpha;5beta;1整联蛋白的扩散和染色更强烈。同一水凝胶中包含RGDS和PHSRN表位的样品（图6A-C）对于alpha;5beta;1整合素也显示比不具有两种序列的样品更强烈的染色（图6D-F）。这支持来自钙黄绿素染色的证据，这表明两种表位的存在增加了细胞在较早时间点的扩散。 PCR和染色实验表明，HUVEC细胞扩散得更快，并且在更大程度上展现出环状RGD序列的水凝胶，甚至更多地在具有环状RGDS和PHSRN序列的凝胶中展开。有趣的是，与远凝胶相比，近凝胶似乎增加了铺展，alpha;5beta;1整合素染色和alpha;5和beta;1整合素表达升高，尽管差异无统计学意义。迄今为止，大多数研究RGDS和PHSRN序列间距的工作都考虑到两者之间的距离延长而不是近端间距。有可能alpha;5beta;1整联蛋白比更远的更接近更近的距离。

结论

在这里，我们表明，beta;折叠肽序列可以同时用于生物材料诱导自组装和作为3D水凝胶内的生物配体的间隔基序。 扭曲的纳米纤维beta;折叠双层能够可控制地将不同的生物肽序列从亚纳米精确度从lt;1纳米至超过6纳米。 这些肽形成能够支持HUVECs细胞的水凝胶，并且具有环状RGDS和PHSRN的水凝胶在正确的距离处具有增加的alpha;5整联蛋白基因表达，与具有更远距离处的表位的那些相比。 具有正确协同作用间距的凝胶中的细胞也出现更多的扩散并且具有更大的alpha;5beta;1整联蛋白染色。 最后，这些结果表明，用于在3D环境中控制表位表达的合成自下而上方法对于提高靶向细胞表面蛋白质的特异性是可能的和有价值的。

实验方法

除非另有说明，所有肽合成试剂均购自AGTC Bio-products。肽在2-氯三苯甲基氯树脂上合成。树脂在氮气下储存，与空气接触减至最小，并且在需要时将树脂溶于DCM中。将第一种氨基酸（每克树脂0.3mmol氨基酸）溶于二氯甲烷（DCM）中，并在振荡器中加入到树脂中。然后加入5当量的二异丙基胺（DIPEA），振荡5分钟后再加入1.5当量的DIPEA。 1小时后，未反应的2-氯三苯甲基氯树脂用过量的甲醇封端30分钟。lt;

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