Penicilium griseofulvum CICC 40293对大豆皂醇B的微生物转化研究文献综述

1. 研究目的及意义

我国盛产大豆，在豆油加工副产物中含有丰富的大豆皂醇。查阅文献发现，诸多学者在大豆皂苷活性（抗诱变、抗衰老、抗癌等）方面做了大量研究，然而关于大豆皂苷的水解产物大豆皂苷元的研究并不多。为了能增加废弃大豆渣的利用度和价值，减少环境压力，本课题将以Penicilium griseofulvum CICC 40293为微生物转化体系，以大豆皂醇B为底物进行生物转化，期待得到结构新颖、活性良好的转化产物，丰富该类型五环三萜的结构多样性。

1. 研究思路

首先对大豆皂苷粗品进行水解反应，以得到不同的大豆皂苷元水解产物粗品；其次通过薄层色谱分析进行定性检测、硅胶柱色谱初步分离、HPLC制备分纯大豆皂苷元纯化出大豆皂醇B化合物；再以Penicilium griseofulvum CICC 40293为微生物转化体系，以大豆皂醇B为底物进行生物转化，得到若干转化产物；最后对这些转化产物进行分离纯化、结构鉴定。

三、研究的主要内容及预期目标

1. 大豆皂苷水解产物的制备

1.1酸性水解

取大豆皂苷粗品，加盐酸浓度为2mol/L的混合有机溶剂进行反应，油浴，搅拌，反应5小时，水解后调PH至中性（NaOH：0.1g/ml），加大量纯水，发现有大量黑灰色沉淀析出，过滤得沉淀，水浴挥干，分别加二氯甲烷、丙酮溶解后抽滤，收集滤液蒸干，得混合大豆皂苷元。

1.2苷元分离

将得到的混合大豆皂苷元进行柱色谱分离，得到不同馏分，分别对不同馏分进行结构鉴定，确定大豆皂苷元B并大量制备。

1. Penicilium griseofulvum CICC 40293的培养

2.1配置豆粕培养基

豆粕培养基：葡萄糖20g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二甲5g/L，酵母粉5g/L，豆粕0.25-0.3g/瓶。培养基50mL/瓶，共40瓶。

培养基灭菌：高压蒸汽灭菌法；灭菌条件：121℃，20min。

2.2接种

将Penicilium griseofulvum CICC 40293菌株接种于两瓶豆粕液体培养基中（50ml/250mL三角瓶），28℃，180rpm/min，培养24h。后将1.6mL/瓶的种子液转接到新鲜液体培养基中（40瓶），在180rpm/min，28℃条件下培养24h。

2.3 Penicilium griseofulvum CICC 40293对大豆皂醇B的微生物转化

菌种生长24h后，对向每瓶中加入大豆皂醇B的乙醇溶液（底物浓度10mg/mL），在相同条件下继续培养4天后收获。

1. 对转化产物进行提取分离

合并发酵液以1.2倍乙酸乙酯萃取三次，有机层减压浓缩旋干，用甲醇溶解并转移至西林瓶中水浴挥干。相同方法转化3批后，以甲醇溶解样品，再经硅胶柱层析法分离，以二氯甲烷：甲醇系统进行梯度洗脱。最后通过高效液相制备分离方法得到纯化合物。

1. 结构鉴定及构效关系研究

通过质谱及核磁等分析方法进行结构鉴定。

四、文献综述

微生物转化就是利用微生物代谢过程中某种酶或某组混和酶对底物进行催化反应，与传统的化学合成方法相比，由于微生物转化反应属于酶促反应，因此对底物的立体结构具有高度的选择性，且具有反应条件温和、设备简单、公害少、反应速率快、收率高以及成本低等诸多优点^【1】。

五环三萜类皂苷是天然产物中一类重要的活性化合物，药理活性好，且在自然界中含量丰富，十分具有研究价值。大豆皂苷是存在于大豆中的五环三萜类齐墩果烷型糖苷，由非极性的三萜苷元（glycones）和低聚糖链（glycone）构成。按照苷元的不同，主要分为A类、B类、E类和DDMP皂苷^【2-4】。A类皂苷是以Soyasapogenol A为配基的双糖皂苷，B类和E类是分别以Soyasapogenol B、Soyasapogenol E为配基的单糖皂苷，DDMP类皂苷则是Soyasapogeno B上C-22位连有DDMP基团^【5】。目前对大豆皂苷的药理活性限于大豆皂苷混合物，很少有大豆皂苷具体结构活性研究的报道。大豆皂苷粗品具有抗诱变^【6】、 抗衰老^【7】、 抗癌^【8、9】、 降血糖^【10】、降血脂^{【11、12】}等活性。

根据Kudou等^【13】的研究发现，DDMP类皂苷是B类皂苷在大豆中的天然存在形式。E类皂苷是4组皂苷中含量最少的，有研究认为它是B类皂苷的光氧化产物^【14】。因此，本实验以大豆皂醇B为例进行微生物转化研究。

在大豆皂苷的前期处理中，一般经有机溶剂提取得到的大豆皂苷都是上述几组大豆皂苷的混合物。大多数皂苷极性较大，易溶于水、含水稀醇、热甲醇和乙醇，难溶于丙酮、乙醚、苯等极性小的有机溶剂。皂苷经酶或酸水解生成的皂苷元为结晶状物质，易溶于丙酮、乙醚、三氯甲烷等有机溶剂。SHIRAIWA^【15】等人曾采用凝胶柱分离得到A组和B组皂苷，其中B组皂苷由I、II、III、IV、V 5个单体组成。谷利伟^【16】等人通过薄层色谱和高效液相制备色谱分离B组皂苷得到皂苷I和II。徐龙权^【17】等人前期采用AB-8大孔吸附树脂从脱脂大豆中提取大豆皂苷，并利用硅胶柱层析法来分离大豆皂苷，得到B组皂苷II。其中，硅胶柱层析法能够将粗提到的大豆皂苷分离成单组皂苷。分离到的产物通过HPLC-MS法分析，确定为B组大豆皂苷。

笔者认为，经过经济和效率的综合考虑，大豆皂苷水解产物采用有机溶剂提取进行初步分离，再经硅胶柱层析法即可得到较纯大豆皂醇B，最后通过高效液相制备色谱进一步纯化，可应用近年来发展起来的高效液相色谱一质谱(HPLC-MS)联用技术对大豆皂苷中的单体皂苷进行鉴定，如此可确保生物转化中底物的唯一性。

课题前期进行大豆皂苷水解产物制备的预实验，对大豆皂苷粗品进行酸水解反应，后采用乙酸乙酯萃取3次，用旋转蒸发仪浓缩产物，通过硅胶柱色谱进行分离，平均每次分离可得到34mg/g的水解产物粗品，皂苷元含量相对较高。

得到大豆皂苷元粗提物后，进一步对其进行分离纯化。目前来看，皂苷的分离纯化较多的使用薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。薄层色谱法操作步骤多，很繁琐^【18】，而且对于单体大豆皂苷的分离难度较大。而皂苷是一种高沸点且极性大的分子，给气相色谱的分析带来了困难^【19】。反向高效液相色谱应该是最有效的能够分离纯化大豆皂苷的仪器，然而由于大豆皂苷三萜类物质缺乏很好的发色基团（除了连 DDMP 基团的大豆皂苷在295nm处有最大吸收峰），这就大大阻碍了紫外检测分析的可能性，而有些报道中采用示差折光检测器检测皂苷类物质，该检测器的一个致命的弱点是不能用于梯度洗脱^【20】。经过多种方法比较，最终采用HPLC制备液相，紫外检测和蒸发光散射检测进行分离。查阅文献发现，大豆皂苷在205nm处有强吸收峰，254nm处几乎没有吸收；非DDMP 类大豆皂苷在205nm处具有较强吸收（甲醇在205nm处具有较强的末端吸收信号，为了避免干扰，监控波长调整在215nm）^【21】。

HPLC制备条件确认如下：

固定相：十八烷基键合硅胶（ODS柱）；样品：皂苷样品溶于甲醇溶液；流动相：A：0.2%(V/V)甲酸-水溶液，B：乙腈溶液；检测波长：210nm；检测时间：40min。

通过以上讨论，最终可建立大豆皂醇B的分离分析方法。

然而查阅文献发现，关于皂苷元的微生物转化研究并不多。故而本课题以Penicilium griseofulvum CICC 40293为微生物转化体系，进行大豆皂苷元的微生物转化，分析可能存在的结构新颖、活性良好的转化产物，有很好的研究前景。

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