毛叶藜芦中三种新的抑制Hedgehog通路的生物碱外文翻译资料

毛叶藜芦中三种新的抑制Hedgehog通路的生物碱

摘要：目的：从天然来源的植物毛叶藜芦中寻找对Hedgehog信号通路有抑制作用的活性生物碱，从而为治疗与Hedgehog信号相关的各种癌症提供潜在的化合物；方法：采用天然药物化学常用技术进行活性生物碱的分离提取，利用核磁共振成像技术（1D和2D）以及已知化合物的光谱数据对比对所得化合物进行结构鉴定，采用细胞水平的生物活性测定系统（Shh-LIGHT 2 细胞）对所得化合物的Hedgehog信号通路的抑制活性进行评价；结果：从毛叶藜芦的乙醇提取物中分离得到三种新的甾体生物碱1~3以及四种已知结构的化合物4~7。结论：化合物1~3和5在0.63～3.11 mM的浓度范围下表现出明显的抑制活性，其中5表现出最显著的抑制活性（IC50＝0.63plusmn;0.02 mM）。

关键词：生物碱；毛叶藜芦；Hedgehog信号通路；Shh-light 2细胞；癌症

Hedgehog(Hh)信号通路在调控细胞增殖和分化的胚胎发育过程中起着至关重要的作用。哺乳动物中Hedgehog通路的主要组成包括三种分泌配体（Sonic Hh，Indian Hh和Desert Hh)，12次跨膜受体蛋白Ptch 1和2(Ptch1和Ptch2),7次跨膜蛋白Smoothened(Smo)和神经胶质瘤相关癌基因(Gli)转录因子1-3(Gli1,Gli2和Gli3)。在Hh配体不存在的情况下，Ptch1阻碍Smo蛋白向初级纤毛的转移，而如果Ptch1与配体结合并形成复合物时，Smo蛋白的抑制作用将被取消，下游通道激活，使得细胞核内转录发生和Gli转录因子的激活。Hedgehog通路对于人体组织的维护与修复是非常重要的，但是它的异常活化参与了很多人类肿瘤的发生，如基底细胞癌综合征（BCC）、髓母细胞瘤、横纹肌肉瘤和其他恶性肿瘤包括胰腺癌、胃癌、乳腺癌、白血病等。因此，抑制Hh通路是治疗多种人类癌症的一种非常有效的方法。

一些Hh抑制剂已经完成了临床试验，其中Cyclopamine（环巴胺）是一种典型的从加州藜芦中分离得到的可直接结合Smo阻断Hh通路的生物碱，但由于溶解性和稳定性较差，以及活性一般，其临床应用没有得到发展。最近几年，一些更有效和更特异的Smo蛋白抑制剂在治疗各种癌症的临床试验中进行了研究，这些抑制剂有saridegib (IPI-926), BMS-833923, PF-04449913, LEQ 506, LY2940680和TAK-441。除此之外，目前正在对调节Smo下游的其它抑制剂(Gant-58、Gant-61和HPI1-4)以及与Sonic Hh(ROBOtN激肽)的结合进行临床研究。迄今为止，Vismodegib (Erivedge) and Sonidegib (Odomzo)是两种FDA批准的仅用于治疗局部晚期BCC的药物，同时只有vismodegib在2012年时被批准用于治疗转移性基底细胞癌。它们选择性地结合Smo蛋白，并且抑制Smo蛋白下游的活化，从而抑制肿瘤的增殖和生长。显然，在抗癌药物发展中,Hh抑制剂被认为是阻断Hh通路的重要靶点。

常用于筛选天然来源的Hh抑制剂的是一种在NIH-3T3细胞中构建的表达外源Gli 1报告基因的生物检测系统,它可以稳定地转染Gli依赖性荧光素酶报告子(shh-light 2细胞)。许多报道的天然活性产物都是通过这种方法测定的，比如卟啉B和F，柚皮素D，黄豆苷D，甾体阿格列锥和带叶黄芩苷A。我们从浙江省毛叶藜芦的全株植物中共分离得到七种结构确定的甾体生物碱，其中包括三种新化合物，有4个化合物在Shh-Liht2细胞中显示出有具有应用前景的Hh通路抑制活性。

在我们的分离实验中，首先将毛叶藜芦（干重1.5kg）的乙醇提取物经过多次正相硅胶柱分离，、反相ODS（十八烷基甲硅烷基硅烷）柱分离，最后再将得到的活性成分用反相高效液相色谱法进一步纯化，得到了生物碱1~7（图1）。

图1 生物碱1～7的化学结构

化合物1为无色棒状固体，它的分子式为 C₂₉H₄₅NO₄ ，通过HR-ESI-MS(m/z 472.3454 [M H] , Calcd 472.3427)以及核磁共振数据分析相结合确定的。化合物1的¹ H NMR光谱显示有五种甲基信号的存在，它们分别为dH 0.98(3H,s, CH ₃-18),1.02(3H, s, CH ₃ -19),1.29(3H, s,CH ₃ -21),0.95(3H, d, J = 6.6 Hz, CH ₃ -27)和2.05(3H, s, CH ₃ CO)。同时，它们在¹³C NMR谱中表现的信号为dC 10.2 (C-18),19.7(C-19),27.3(C-21),19.2(C-27)和22.0(CH ₃ CO)（表1）。在¹ H NMR光谱上显示的特征信号dH 4.71(dd,J = 11.0, 4.7 Hz, H-12)在酯基上，在¹ H NMR光谱同时显示了一个含氧甲基的氢信号dH 3.39(m,H-3)以及一个烯烃氢原子信号dH 5.35(brd,J = 5.0Hz,H-6)。¹³C NMR和DEPT谱使用CD ₃ OD和CDCl ₃作为两种不同的溶剂显示了29个炭原子的信号，它们包括五个甲基（dC 10.2，19.2，19.7，22，27.3），十个亚甲基（dC 24.2，24.4，24.8，28.5，28.7，32.2，42.9 32.4,38.4，56.4），八个次甲基（dC 28.5，31.5，50.5，72.3，82.6，57.2,58.0，122.3），六个季炭（dC 37.7,48.5，76.4，142.1，172.5，176.8）。

表1 化合物1~3的¹H（500MHz）和¹³C（125MHz）NMR数据（ppm）

1. 耦合常数(J，Hz)的缩写意义在括号内(s：单峰；d：双峰；dd：双峰；DDD：双峰的双线；m：多峰；br：单峰宽；br d：宽双峰；br d：宽双峰)。
2. 这些数据在CD3 OD中未被发现，但使用CDCl3作为NMR溶剂时可被发现。

此外，各种质子和碳信号的归属通过¹H-¹H COSY和HMBC相关性的测定得到了证实(图2)。¹ H- ¹H COSY谱显示了以下几处氢的偶联信号：H-3与H-2、H-4偶联相关，H-6与H-7的烯属质子偶联相关，H-11与H-12、H-9的亚甲基偶联相关，以及H-25与H-24，H-26和CH3-27的次甲基偶联相关。HMBC谱则显示了以下几处碳信号的相关性： CH₃ -18(dH 0.98)与C-12(dC 82.6)、C-17(dC 58.0)之间有相关性，CH₃-19(d H 1.02) 与C-5(dC 142.1)、C-9(dC 50.5)之间有相关性，这表明这两个CH₃基团分别位于C-13和C-10处。在H-12（dH 4.71)和CH ₃CO（dC 172.5）之间观察到的HMBC相关性证实了这种邻位取代的C-12（dC 82.6）的CH基团连接了CH₃CO基团。CH ₃-21(d H 1.29)由于其与C-17(dC 58.0)、C-20(dC 76.4)和C-22 (d C 176.8)之间的相关性使得它处于C-20(dC 76.4)位。此外，H-12在d 4.71(dd, J = 11.0, 4.7 Hz)的偶和常数显示H-12在轴向位置，同时它也显示了H-12与H-9，H-14和h-17之间有NOESY交叉信号（图3）。C-20处的结构则根据所报道过的文献可推断为R，这些报道均为来自这类物种的藜芦生物碱类化合物，比如狭叶乙素B-3-O-B-D-吡喃葡萄糖苷和大理藜芦碱B。25R的结构可通过H-26a在d 3.02的轴向定位和H-25在d1.63(J = 9.5 Hz)的信号确定，这表明了H-25的轴向位置和 CH₃-27的平伏位置。它也通过CH₃-27 / H-26a的NOESY相关性得到了确认。所以，化合物1为如图所示，它的名称为(20R，25R)-12b-O-乙酰基-20b-hydroxyisoverazine。

图2 化合物1的关键HMBC相关和¹H–¹H COSY 图3 化合物1在NOESY中的关键NOE关联

化合物2为无色粉末，经过NMR和 HR-ESI-MS 数据(m/z 634.3974 [M H] ,Calcd 634.3955). [ a ] D25 80.7 (c 0.276,CHCl3 )的分析鉴定，其分子式为 C ₃₅ H ₅₅ NO ₉ 。除了一个增加的葡萄糖单元外，化合物2(表1)的¹H和¹³CNMR谱与化合物1的非常相似。这个假设是根据以下信号推断的：dH 4.41 (d, J = 7.5Hz,H-1)，3.35 (dd, J = 7.9 Hz, H-2)，3.54 (dd, J = 8.4 Hz, H-3)，3.60(m, H-4) ，3.32 (m, H-5)，3.71 (m, H a -6)和3.63 (m,Hb -6)。 葡萄糖上一个耦合常数为J=7.5 Hz的端头氢原子表明它为beta;-的连接方式。HMBC谱也进一步证明了这一点(图4)，它的结果表明，dH 4.41(d，J=7.5，H-1 0)与dc 79.4(C-3)之间存在相关关系，表明葡萄糖部分附着在C3上。化合物2的其他基团的相关性与1的HMBC信号相类似(图4)。在H-12与H-17、H-21和H-27、H-1 0与H3之间观察到了NOESY的关键相关性(图5)。在此基础上，化合物2的结构可确定为(20R，25R)-12beta;-O乙酰基-20beta;-羟基异烟肼-3-O-beta;-D-葡萄糖苷。

图4 化合物2的关键HMBC相关性和¹H-¹H COSY

图5 化合物2在NOESY中的关键NOE关联

化合物3为无色粉末，HR-ESI-MS[M H] 测试推导了分子式为C₃₅H₅₃ NO₉(m/z632.3793，Calcd 632.3799)。3的¹ H和¹³ cNMR谱的信号与2有相似之处，它们的主要差异是在氮六杂环中观察到在dc204.5处存在一个羰基的特征信号。CH₃-21(dH 1.09)的主要HMBC相关关系是与C-17(dC 54.4)、C-20(dC 40.5)和C-23(dC 204.5)之间的相关信号。H-20(d H 3.83)/C-13(d C 46.3)、C-15(d C 26.0)、C-17(d C 54.4)和C-23(d C 204.5)的HMBC信号进一步支持了这些连接(图6)。3的相对立体化学与2的立体化学基本一致。与文献相比，该化合物的结构接近于veralodinine，仅显示了一些典型的质子核磁共振信号。从这些观察中，确定3为(20R，25R)-异羟戊二胺。

图6 化合物3的关键HMBC相关性和¹H-^1<!--

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