围产期BPA暴露导致的大鼠早期肝细胞DNA甲基化修饰改变使大鼠成年后产生胰岛素抵抗外文翻译资料

围产期BPA暴露导致的大鼠早期肝细胞DNA甲基化修饰改变使大鼠成年后产生胰岛素抵抗

摘要：

目的：双酚A（BPA）是广泛分布于环境的内分泌干扰物，围产期暴露于BPA与后代胰岛素抵抗和糖尿病有关。其根本机制可能与表观遗传学有关，通过DNA甲基化提示生命早期环境暴露而诱发不良影响。在这项研究中，我们试图阐明围产期暴露于BPA与大鼠肝DNA甲基化改变之间的关系。方法：在整个妊娠期和哺乳期通过灌胃给Wistar大鼠给予BPA或玉米油（50mu;g/ kg /天），检测出生后的第3周和第21周雄性后代的胰岛素抗性和肝DNA甲基化有关的变量。结果：与对照组相比，经过BPA处理的后代中，血清胰岛素和胰岛素抵抗指数增加，并且第21周的胰岛素敏感性指数和肝糖原贮存与对照组相比降低，但是在3周这些变量都没有显著改变。然而，第3周肝总DNA甲基化水平下降，同时伴随着DNA甲基转移酶3B mRNA的过度表达。同时，围生期暴露于BPA诱导的启动子高甲基化和肝葡萄糖激酶基因表达减少。此外，在第21周，经过BPA处理的后代中Gck启动子甲基化增加变得更为明显。结论：围产期BPA暴露，肝组织异常的DNA甲基化发生于胰岛素抵发展之前。这些发现支持了表观遗传学在通过BPA诱导的代谢紊乱导致胎儿重编程中的潜在作用。

关键词：BPA，DNA甲基化，Gck，围产期暴露

缩略词：

1.引言

双酚A（BPA）是一种典型的内分泌干扰物，在全世界广泛的生产，常用于食品和饮料容器的制造[1]。人类流行病学研究表明，暴露于高水平的BPA与糖尿病、肝酶异常、及心脑血管疾病的发生有关[2,3]。此外，暴露于BPA可以破坏全身葡萄糖稳态，诱导胰岛素抵抗和促进代谢紊乱的这一设想有广泛的动物实验研究支持[4,5]。

由于围产期环境损害，导致持续性暴露于化学物质，已经被假设为使许多人成年人慢性病的风险增加[6,7]。我们以往的研究表明，在围产期暴露于参考剂量为50mu;g/kg/天的BPA，子代成年后易患胰岛素抵抗和葡萄糖耐受不良，受到成人疾病的胎儿起源的支持[5]。越来越多的证据表明，成人疾病胎儿基础的分子机制与表观遗传修饰有关[8]。在胎儿的发育期间，DNA甲基化是调节基因表达的主要表观遗传机制[9]。表观遗传变化不仅在解释环境相关疾病的分子基础上有重要作用，并且还可以作为在毒性评估的生物标志物[10]。然而，目前尚不清楚围产期BPA暴露是否可能对生命早期修饰表观基因组产生影响。

肝脏在维持葡糖糖的储存与释放之间的平衡中发挥着重要作用。当血糖水平高时，肝脏摄取葡糖糖并将其转化为糖原进行储。肝功能的改变直接影响到葡萄糖在体内的平衡，最终影响生物体的整体健康状况。葡萄糖激酶（GCK）引起的葡萄糖磷酸化发生于葡萄糖代谢的初期，并且在调节肝细胞中的葡萄糖的使用起重要的作用[11]。GCK活性的降低已被发现与2型糖尿病有关[12],并且，GCK基因突变可以使得年轻人发生成年型糖尿病[13]。因此，Gck被认定为糖尿病的易感性基因。在这项研究中，研究了通过灌胃的方式，在围产期暴露于50mu;g/kg/日的BPA的子代雄性大鼠葡萄糖代谢的影响。我们检测了肝脏总DNA甲基化和GCK启动子甲基化修饰，发现了围产期暴露于BPA促进了胰岛素抵抗。

2.方法

用于本研究所有动物实验的动物均遵循由同济医学院（华中科技大学，武汉，中国）所指定的动物护理和使用指南，并经同济医学院伦理委员会批准。Wistar小鼠（湖北省实验动物研究中心，湖北，中国）饲养于可以自由获得食物和水的无特殊病原体的环境，并控制标准光照/黑暗条件（12h光照/黑暗 周期）。当出现精子阳性涂片的那天，设定为妊娠第0天（GD 0）。将怀孕的大鼠分为两组，通过口服灌胃的方法，一组予玉米油（Sigma-Aldrich，St Louis，MO，美国），另一组予溶于玉米油的BPA（50mu;g/kg/GD 0）直至断奶三周。 食物中的叶酸用VitaFast叶酸试剂盒（ifp Institutfuuml;rProduktqualitauml;t，柏林，德国）检测。

在第3周，从各组中随机的选择雄性子鼠，进行称重后通过断头术处死，取出肝脏，速冻，然后冻存在-80℃以备用。为了控制窝效应，选择来自不同窝的后代进行下述的BPA处理组和对照组的实验。在每个实验条件下对每只子鼠进行三次分析。

使用手持式商业血糖仪（ACCUCHEK Active; Roche，Mannheim，德国）测定血糖。 通过市售RIA试剂盒（Linco Research，Millipore，Billerica，MA，美国）测定血清胰岛素浓度。 胰岛素抵抗状态通过 胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）[14]和胰岛素敏感指数（ISI）进行评估[15]。

每组中的其余幼仔给予普通饮食（不含BPA），并且予以相同的处理保持至21周。

2.1组织学检查和肝组织中糖原的测定

将组织肝脏用4％多聚甲醛固定后包埋在石蜡中，切成4mu;m，并用过碘酸希夫（PAS）染色。 在光学显微镜下观察载玻片（Olympus IX71，东京，日本）。如前所述测量肝糖原含量[16]。 简言之，将肝脏样品（n = 6 /组）称重并在100℃下在四个体积（vol./wt）的1mol / l KOH中水浴20分钟。然后将裂解物用水稀释10倍，并缓慢加入蒽酮试剂中。 将混合物在沸水中加热5分钟。 使用葡萄糖作为标准作为空白对照，测量620nm处的吸光度。

2.2总DNA甲基化分析

根据制造商的说明，使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒（Promega，Madison，WI，美国）提取来自肝脏样品的基因组DNA（n = 6 /组）。

将DNA样品（含有1.0mu;gDNA）与0.2ml氢氟酸（48％）混合，在80℃下水解6小时，然后用氮气干燥。 残余物用甲醇稀释并在15,000g下离心5分钟。 提取上清液部分并过滤用于分析。

如上所述，通过偶联到配备有电喷雾电离源（Agilent，Redwood City，CA，美国）的三重四极质谱仪的Agilent 6400系列LC来测定总DNA甲基化[17]，对6组样品进行了三次分析。 胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶和甲酸铵购自Sigma-Aldrich（HPLC级，纯度gt; 99％）。甲醇和乙腈（HPLC级）购自Merck（Merck Millipore，Darmstadt，Germany）。其他所有的试剂均为分析级。使用BHI HILIC柱（1.7mu;m，2.1times;100mm；Waters，Milford，MA，美国）用流动相分离，流动相为乙腈和2.5mmol / l铵共振液（93：7），流速为0.2毫升/分钟。量化管理通过反应监测模式（MRM）监测胞嘧啶的m / z112.1 / 95.1转变对和5-甲基胞嘧啶m / z 126.07 / 109.1实现。数据采集处理和仪器控制由MassHunter Optimizer软件B.03.01（Agilent）执行。

为了验证总DNA甲基化的变化，使用上述相同的程序，对每组另外六只大鼠进行重复试验。

2.3Gck启动子基因组测序的重亚硫酸盐测序

将来自肝样品的DNA进行亚硫酸氢钠（Sigma-Aldrich）处理[18]。

用于大鼠Gck启动子的亚硫酸氢盐测序引物列于电子补充材料（ESM）表1中。GG启动子序列（-413至-95）用GoTaq Hot Start Green Master Mix（Promega）在以下条件下通过PCR扩增：94℃3分钟，94℃30秒，59℃30秒，72℃30秒，40个循环，最后72℃7分钟。 PCR产物在2％琼脂糖凝胶上分离，并使用Wizard SV Gel和PCR Clean-Up System（Promega）通过凝胶提取纯化，然后使用TA克隆试剂盒双启动子克隆入pCR2.1载体(Invitrogen，Grand Island，NY，美国)。 使用TIANprep Mini Plasmid Kit（TIANGEN，北京，中国）制备来自10个集落（n = 4 /组）的质粒DNA并测序。

2.4 RNA制备和mRNA定量

使用Trizol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，美国）从肝脏组织中分离总RNA，使用Revert Aid First Strand cDNA合成试剂盒（Fermentas，Hanover，MD，美国）进行cDNA合成的逆转录。mRNA的表达通过使用Applied Biosystems 7900HT型快速实时PCR系统进行定量实时PCR检测。管家基因beta;-肌动蛋白、Gck、Pparg、Sp1、Lxra（Nr1h3）、Srebp-1c（Srebf1），Hnf1a，G6p（G6pc），Dnmt3b和 Dnmt1在ESM表1中提供。实时PCR循环条件为95℃2分钟，然后95℃变性15秒和60℃退火和延伸1分钟的40个循环，通过Beta;-actin作为内参的2^{-Delta;Delta;Ct}方法进行相对的基因表达计算。

2.5 Western印迹分析

使用Proteo-Jet细胞质和核提取试剂盒从肝组织中提取蛋白质 (Fermentas，Saint-Reacute;my -legrave;s-Chevreuses，法国)，通过Bradford蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度（Beyotime，上海，中国）。用来自Abcam的一级抗体探测肝蛋白质进行分离（剑桥，英国）：DNA甲基转移酶B（DNMT3B）、ab2851； DNA（胞嘧啶-5）- 甲基转移酶（DNMT1）、ab92453；GCK、ab37796。将谱带强度标准化为beta;肌动蛋白（n = 3 /组）。

1. 统计分析

数据以平均值plusmn;SE表示。 统计分析使用SPSS 13.0（SPSS，Chicago，IL，美国）。通过Students t检验和单向ANOVA评估对照组和治疗组之间的显着差异。p lt;0.05则认为差异具有显著的统计学意义。

4.结果

4.1动物数据

母鼠在暴露于BPA后，没有诱发任何毒性迹象，食物消耗及妊娠时间没有变化，子代没有发生畸形，子代的数量、性别比例和产后存活方面也未观察到显著的影响。食用的叶酸含量为4.3 mg / kg。

子代的体重，血糖浓度，HOMA-IR，ISI和血清胰岛素水平显示于图1。在第3周，来自BPA处理组的子代，其血清胰岛素水平高于对照组，但是两组之间的体重、血糖、HOMA-IR或ISI没有显着差异。在21周时，BPA处理组的大鼠体重增加（p lt;0.05），血清胰岛素和HOMA-IR显着增加（p lt;0.01）ISI显着降低（p lt;0.05） ，BPA组的血糖略高，但差异不显着。

4.2组织学变化和肝糖原含量

通过使用PAS技术，当比较对照组的后代（图2a）和第3周时BPA处理组的后代（图2b）时，肝脏中的组织学没有观察到显着变化。在第21周，糖原沉积物与对照相比（图2c），BPA处理的后代肝脏中降低（图2d），正如PAS阴性区域的发生率所指示的，表明糖原储存的显着减少。

在第3周时，BPA处理的大鼠的后代中肝糖原含量轻微降低，但差异不显着（p = 0.076）（图2e）。 在第21周，BPA处理的大鼠的后代（4.26plusmn;1.20mg / g组织）与对照的后代（8.72plusmn;1.26mg / g组织）相比肝脏糖原含量显着降低（p lt;0.01）（图2f）

4.3 BPA对肝组织DNA甲基化及DNA甲基化转移酶表达的影响

图3显示了来自肝脏样品的三重分析的数据的平均值。与对照（5.38plusmn;0.20％）相比，经BPA处理的大鼠的后代中肝脏总DNA甲基化程度变得低甲基化（4.32plusmn;0.23％）（p lt;0.05）（图3a）。在第21周时，与对照组（5.28plusmn;0.31％）相比，经BPA处理的大鼠后代中的总DNA甲基化程度显着降低（3.61plusmn;0.22％）（图3a）（n = 6）。随机选择每组另外的六只大鼠作为独立样本，以验证总DNA

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