基于SCoT分析建立种特异性SCAR标记鉴定酸浆属（茄科）植物外文翻译资料

基于SCoT分析建立种特异性SCAR标记鉴定酸浆属（茄科）植物

原文作者 Shangguo Feng, Yujia Zhu, Chenliang Yu, Kaili Jiao, Mengying Jiang, Jiangjie Lu, Chenjia Shen, Qicai Ying and Huizhong Wang 单位 Hangzhou Normal University

摘要：酸浆是茄科的一个重要属。它包括许多具有重要药用价值、食用价值和观赏价值的物种。然而，许多酸浆属植物由于其相似的形态特征而容易混淆，阻碍了酸浆资源的利用和保护。因此，有必要建立快速、灵敏、可靠的酸浆属植物鉴定方法。为此，在本研究中，基于一个简单而新颖的标记系统，即起始密码子靶向（SCoT）标记，开发了物种特异序列特征化扩增区（SCAR）标记，用于准确鉴定密切相关的酸浆物种P.angulata、P.minima、P.pubescens和P.alkekengi var.franchetii。共筛选出34个SCoT引物，获得289个可靠的SCoT位点，其中265个位点具有多态性。从酸浆属植物中成功鉴定、克隆和测序了四个物种特异的SCoT片段（SCoT3-1404、SCoT3-1589、SCoT5-550和SCoT36-520）。基于这些特定的DNA片段，我们开发了四个SCAR引物，分别命名为DST3KZ、ST3MSJ、ST5SJ和ST36XSJ.PCR方法对每个引物对的分析清楚地表明，在所有目标酸浆物种样品中都有一个特定的扩增带，但在其他酸浆物种中没有观察到扩增。因此，本研究开发的物种特异性SCAR引物对可以作为快速、有效、可靠地鉴定和区分酸浆属物种的有力工具。

关键词：酸浆属物种；物种特异性；SCoT标记；SCAR标记；标记发展

简介

酸浆属（茄科）由75-120种组成，主要分布在美国热带和温带地区（中国科学院，1978；Whitson and Manos，2005；Wei et al.，2012；Feng et al.，2016b）。然而，P. angulata, P. minima, P. pubescens,和 P. alkekengi var. franchetii主要分布在中国（中国科学院，1978）。它们具有多种药理活性，如抗氧化、抗炎和抗癌作用，其中大多数物种长期以来被用作治疗疟疾、风湿、肝炎、哮喘和癌症的中草药（Jietal.，2013；Ding et al.，2014；继续职业教育委员会，2015；Xu等人，2016）。此外，标准的酸浆属药用植物P.alkekengi var.franchetii已被纳入中国药典（继续专业教育委员会，2015）。此外，一些酸浆种，包括P.philadelphica、P.peruviana和P .pubescen具有重要的食用价值和食用价值，已在世界许多地区种植，比如中国和欧洲近年来，酸浆属植物越来越受到人们的关注，特别是其化学成分和药理特性（Ji等人，2013；Ding等人，2014；Li等人，2014；Yang等人，2016；张和彤，2016；孙等，2017）。然而，目前对酸浆属植物的分类鉴定研究还比较薄弱。酸浆属植物的形态特征极为相似，很容易受到环境和植物发育阶段的影响，这使得利用形态学方法进行区分非常困难，有时甚至不可能（Wei等人，2012；Feng等人，2016b）。此外，由于过度开发和城市化进程的加快，天然酸浆资源已经濒临灭绝，特别是在中国的许多地区（Feng等人，2016b）。这些问题制约了酸浆的利用和酸浆产业的发展。因此，有必要建立一种快速有效的物种鉴定方法，以便更好地利用和保护酸浆属植物资源。

与表型性状相比，分子标记独立于环境条件，具有较高的可靠性。它们已被现代分类学家广泛用作改进系统发育分析和鉴定许多不同植物物种的重要工具（Mulpuri et al.，2013；Feng et al.，2015a，b）。目前，只有少数分子标记应用于酸浆属植物的遗传关系和多样性研究（Whitson and Manos，2005；Vargas-Ponce et al.，2011；Wei et al.，2012；Labate and Robertson，2015；Feng etal.，2016b）。

作为一个简单而新颖的标记系统，起始密码子靶向（SCoT）标记是基于植物基因中短保守区的起始密码子（ATG）开发的（Collardand Mackill，2009）。SCoT标记不需要序列信息，与功能基因和相应性状相关（Mulpuri等人，2013）。与随机扩增多态性DNA（RAPD）、简单序列间重复序列（ISSR）和简单序列重复序列（SSR）相比，SCoT使用了更长的引物（18个碱基18个碱基）产生更多的多态性。它已广泛用于遗传多样性研究、系统发育分析和许多植物的标记辅助育种（Collard和Mackill，2009；Luo等人，2010、2011、2012；Xiong等人，2011；Guo等人，2012；Mulpuri等人，2013；Feng等人，2015a、2016a）。然而，由于SCoT标记作为rapd和issr标记时对实验条件和PCR产物的复杂性相对敏感，因此很少直接用于物种鉴定。为了缓解使用传统分子标记技术时出现的问题，开发了序列特征扩增区（SCAR）标记系统（Paran和Michelmore，1993）。作为基于PCR的网络标记之一，ScarsouldbederivedfromRAPD（Josephetal.，2014）、ISSR（Leetal.，2011）、SCoT（Mulpurietal.，2013）、逆转录转座子间扩增多态性（IRAP）（Xiao et al.，2011；Mandoulakani et al.，2015）和内含子长度多态性（ILP）（Shimada et al.，2009）标记。它代表一个特定的、定义明确的基因组DNA片段，该片段通过使用一对特定引物的PCR扩增进行检测。与传统的分子标记相比，SCAR在用于植物鉴定和/或种间鉴定时更简单、更具重现性和可靠性（Leetal.，2011；Cirilloetal.，2012；Mulpurietal.，2013；Marieschi etal.，2016）。由于SCoT与功能基因和相应性状有关，SCoT-SCAR具有较好的稳定性和特异性。本研究的目的是开发物种特异性SCAR标记，基于SCoT分析，用于识别四种常见的酸浆植物（P.minima，P.angulata，P.alkekengi var.franchetii,和P.pubescens)。

材料与方法

植物材料与DNA提取

从中国四种酸浆属植物的自然分布区收集的20个个体被用于筛选特定标记（表1）。这些个体是酸浆属常见的药用植物，如《中国药典》收录的酸浆（续专业教育委员会，2015）。此外，使用16个P.angulata种样品、10个P.pubescens种样品、10个P.alkekengi var.franchetii样品和10个P.minima种样品来验证开发的SCAR标记（补充表S1）。为了鉴定和确认采集的样品，使用中国科学院植物研究所植物标本室保存的标本1确认采集的样品。从所有采集样本的新鲜幼叶组织中分离出基因组DNA，并如前所述评估DNA的完整性和质量（Feng等人，2016b）。

表1:SCoT研究中使用的所有酸浆样品的信息。

SCoT-PCR

根据Collard和Mackill（2009）的研究，中国上海三工生物工程技术服务有限公司合成了36个SCoT引物，用于初步引物筛选，每个供试物种使用两个样品。这些引物产生清晰分离的条带，并允许选择稳定和丰富的多态性（表2）。PCR反应在总体积为20micro;l的溶液中进行，其中含有1times;PCR缓冲液[200 mM Tris–HCl（pH 8.8）、100 mM KCl、100 mM（NH4）2SO4、20 mM MgCl2、1%TritonX-100]、0.4 mM dNTPs、每个引物0.5micro;M、1 U Taq DNA聚合酶（中国北京鼎国长生生物技术有限公司）和基因组DNA模板50 ng。使用以下PCR程序进行扩增：在94℃下5分钟，然后在94℃下50 s，在50–60℃下50 s（取决于每个引物的退火温度）35个循环，在72℃下1.5分钟，最后在72℃下延长10分钟。PCR在梯度热循环仪（A200）中进行（杭州龙基科学仪器有限公司，浙江，中国）。PCR产物在1.5%（W/V）琼脂糖凝胶上分离，使用Trans2K DNA标记（TransGen Biotech，北京，中国）作为大小标准，在三醋酸缓冲液中用GelStain（TransGen Biotech）染色并拍照在紫外线下。实验至少重复了两次.

表2 34个SCoT引物的遗传多态性。

SCoT文件分析

SCoT扩增带是通过视觉方式进行评分的，但这是由Quantity One软件（4.6.2版，美国BioRad技术服务部）协助完成的。只有清晰、明确和可复制的SCoT片段被评分为存在（1）或不存在（0）。使用NTSYS pc版本2.10e软件进行聚类分析（Rohlf，2000）。使用算术平均（UPGMA）的未加权对群方法构建了一个与简单匹配（SM）系数一起计算的基于随机图的相似矩阵（Nei和Li，1979）。此外，利用MEGA-6.0软件进行了基于遗传距离的UPGMA分析。

特殊SCoT片段的选择、克隆和测序

将SCoT文件与特定物种中存在的选择性扩增子以及其他所有物种中不存在的扩增子进行比较，这意味着它们可以被视为物种特异性标记。使用引物SCoT2、SCoT3、SCoT4、SCoT5、SCoT19、SCoT22和SCoT36（表3）获得几个合适的标记条带。选择的标记条带从1.5%琼脂糖凝胶中去除，并使用DNA片段快速纯化/回收试剂盒（北京鼎国长生生物技术有限公司）进行纯化。将纯化的DNA片段克隆到pUCm-T载体（上海阳光生物科技有限公司）中，并整合到具有竞争能力的Toultra competentEscherichiacoli株Trans5alpha;细胞中。通过菌落PCR筛选转化菌落，并用M13正向和反向引物对插入大小正确的克隆进行测序。

表3 |酸浆属物种的物种特异SCoT位点。

序列数据分析，SCAR引物设计和验证

使用BLASTN2程序的核苷酸数据库确定获得序列的序列相似性，并将序列保存在GenBank（GenBank：MF566104、MF566105、MF566106和MF566107）（Clarketal.，2016）（表4）。使用Primer Premier 5软件设计引物（Lalitha，2000）。四个SCARprimerpairs，分别命名为dst3kz、ST3MSJ、ST5SJ和st36xsj，它们是根据顺序的scott片段设计的（表4）。设计的引物为19-22个引物，退火温度（Tm）在49.9-61.9℃之间。它们是基于获得的特定片段，由上海桑光生物科技有限公司合成的。，斯卡兰皮有限公司在含有1times;PCRbu ffer[200mM Tris–HCl（pH 8.8）、100mm KCl、100mm（NH4）2SO4、20mm MgCl2，1%TritonX-100]，0.4 mM dNTPs，0.5micro;M正向引物，0.5micro;M反向引物，50 ng DNA，1 U Taq DNA聚合酶（北京鼎国长生生物科技有限公司）。SCAR-PCR扩增在94°C初始中和5min后进行，在94°C初始中和50s后进行35个循环，工作温度为每对SCAR引物（表4）50 s，72°C初始中和1.5min，并在72°C最终延长10min。扩增产物通过电泳在1.5%上解析琼脂糖凝胶和凝胶染色（转基因生物技术）检测。

结果

SCoT分析

在初始引物筛选后，选择34个产生清晰和可重复多态性模式的SCOT引物进行进一步研究（表2）。这34条引物共扩增出289条可靠的SCoT带，其中265条带具有多态性。每个引物的多态性带数在3（SCoT9和SCoT18）到13（SCoT22）之间，平均为7.8。每个引物的多态性带数在55.6%到100.0%之间，平均为90.2%。三个代表性文件（SCoT2、SCoT3和SCOT36）如图1所示。系统发育分析共有289个位点。利用SCoTs提供的二元数据矩阵估计了酸浆样品间的遗传相似性（补充表S2）。UPGMA树状图将酸浆样品分为相似性为0.622的两组（图2）。UPGMA显示，来自同一物种的所有样品都被分为一个组，并且种间存在一个明显的界限（组I包含来自P.minima的四个样品，组II包含P.angulate的九个样品，组III包含来自P.pubescens的三个样品，而所有来自P.alkekengi var.franchetii的样品与其他酸浆属植物相距甚远的被归为IV类（图2）。使用Mega6.0软件对基因距离进行UPGMA分析得出了类似的结果（补充图1）。

SCAR标记的鉴定、序列分析和发展

共有11个SCoT片段，每个片段都是特定物种的特异片段，其他所有物种的SCoT片段中都没有

物种样本（SCoT2-730、SCoT5-550和SCoT22-662是P.alkekengi var.franchetii的特异片段，SCoT3-1404、SCoT19-590和SCoT36-462是P.angulata的特异片段；SCoT3-1589、SCoT22-537和SCoT36-417是P.pubescens的特异片段；SCoT4-1412和SCoT36-520是P.minima的特异片段（见表3）。在克隆和测序过程中，11个

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