开始密码子靶向(SCoT)和靶区扩增多态性(TRAP)评价石斛属植物的亲缘关系外文翻译资料

开始密码子靶向(SCoT)和靶区扩增多态性(TRAP)评价石斛属植物的亲缘关系

Shangguo Feng ^a,b, Refeng He ^b, Sai Yang ^a, Zhe Chen ^b, Mengying Jiang ^b, Jiangjie Lu ^b, Huizhong Wang ^a,b

关键词:石斛，亲缘关系，SCoT ，TRAP

摘要：采用启动密码子靶标(SCoT)和靶区扩增多态性(TRAP)两种分子标记系统对36种中国石斛属植物进行亲缘关系分析。22条SCoT引物共产生337个位点，其中324个(96%)多态性;13条TRAP引物组合共产生510个位点，其中500个(97.8%)多态性。利用SCoT和TRAP引物检测到的平均多态性信息含量分别为0.953和0.983，表明中国石斛物种间存在高度的遗传多样性。基于SCoT和TRAP标记的算术平均树状图和主坐标分析图的非加权对组法聚类结果相似，将36种石斛植物聚类为4个主要类群。本研究结果为石斛资源保护提供了有益的信息，对完善现有的石斛育种方案具有一定的指导意义。结果还表明，SCoT和TRAP标记具有较高的信息价值，可用于评价石斛属植物种间的遗传关系。

1. 导言

石斛属(Dendrobieae:Orchidaceae)是兰科最重要的属之一，包括1000多种兰花，主要分布在热带和亚热带以及澳大利亚北部和东部(Xiang et al.2013)。我国石斛属植物有74种2变种，主要分布在秦岭南部地区(Tsi et al.， 1999)。由于石斛富含多糖、石斛碱等生物活性物质，对人体健康具有药理意义，有报道称石斛具有清除人体组织中积累的有毒物质、增强机体免疫力、降低血糖水平、延长寿命等作用(Bulpitt et al.2007;中国药典编辑委员会，2010)

（缩写:SCoT, Start codon targeted;TRAP，靶区扩增多态性;PIC，多态信息内容;UPGMA，带算术平均值的未加权对群法;PCoA，主坐标分析。）

由于药用植物的商业化生产，石斛属植物在中国医药市场上被大量收集交易。目前，石斛自然种群正面临着严重的灭绝威胁，其主要原因是过度采集和生境破坏。所有的石斛属植物都被列入《濒危动植物种国际贸易公约》(CITES)。利用DNA分子指纹技术了解石斛物种间的遗传多样性及其相互关系，对石斛植物育种和遗传资源保护具有重要意义。目前已有几种不同的分子标记用于评价石斛属植物的亲缘关系和物种鉴定，如随机扩增多态性DNA (RAPD) (Zhang et al.， 2001;Ding等人，2009)，扩增片段长度多态性(AFLP) (Wang等人，2007;Li et al.， 2008)，简单序列间重复(ISSR) (Shen et al.， 2006;Wang et al.， 2009)，序列相关扩增多态性(SRAP) (Fan et al.， 2008;Feng et al.， 2014)，简单序列重复(SSR) (Lu et al.， 2014)，质体和核序列(Lau et al.， 2001;Yao等，2009;Takamiya等，2011;Singh等人，2012年;项等，2013)。起始密码子靶向(SCoT)多态性是一种基于起始密码子翻译的新颖、简单、可靠的基因靶向标记技术(Collard and Mackill, 2009)。根据翻译起始密码子周围的保守区域，ATG (Joshi et al.， 1997;Sawant等人，1999)，为SCoT设计了单一引物并用于放大基因组区域。作为一种新的分子标记方法,SCot标记多态性和效率高，被成功用于大米(Collard and Mackill, 2009),花生(熊et al ., 2011)、芒果(罗et al ., 2010、2011、2012),土豆(Gorji et al ., 2011),葡萄(郭et al ., 2012),麻风树(Mulpuri et al ., 2013),和石蒜属(高et al ., 2014)。最近，SCoT标记也被用于分析印度东北地区的石斛(dendrobium nobilum)的遗传多样性(Bhattacharyya et al.， 2013)。靶区扩增多态性(TRAP)是一种快速、高效的基于PCR的标记技术，利用EST或基因信息产生多态性(Hu和vic, 2003)。诱捕标记使用针对已知DNA基因序列设计的固定引物，并将其与任意引物配对，以内含子或外显子区域为靶点，这些区域具有富含AT或GC的核心(Li和Quiros, 2001)。近年来，诱捕标记技术已被应用于遗传多样性分析(Zhang and Chen, 2010;Luo等，2013;Zhang et al.， 2013)，遗传图谱(Chen et al.， 2006, 2012;Alwala等人，2008年;Andru等，2011)，等等。利用SCoT和TRAP标记对我国石斛属植物的亲缘关系进行了评价，以期为石斛遗传资源的有效利用和保护提供参考。

1. 材料与方法

2.1植物材料和DNA提取

本研究所用的石斛属植物共有36种，分布在中国主要的石斛分布区(表1)，并利用中国科学院植物研究所植物标本室的标本(http://www.nhpe.org)进行了鉴定。研究了三地铁皮风斗加工铁皮石斛的软胶和英胶两种类型。从每个物种的三个个体中随机收集新鲜的、年轻的叶子，混合用于基因组DNA分离。如前所述分离基因组DNA (Feng et al.， 2013)。用0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性和质量，用紫外分光光度计测定基因组DNA样品的浓度。

表1 列入本研究的石斛属植物样品清单。

样品代码 物种名称 片段 编码 地区

2.2SCoT分析

根据Collard and Mackill(2009)设计合成的引物序列，选择36条SCoT引物由中国上海生工生物工程技术服务有限公司合成, 筛选出条带分离清晰、扩增稳定、多态性丰富的引物22条(表2)。PCR在20mu;Lv ol u m s中进行，缓冲液为1 times; PCR buffer (100 mM Tris-HCl、100 mM (NH4)2SO₄、100 mM KCl、1% TritonX-100、pH 8.8)、2.5 mM Mg² 、0.4 mM dNTPs、0.5 mu;M引物、1 u Taq DNA聚合酶(TaKaRa Bio., Kyoto, Japan)和50 ng基因组DNA模板。扩增在MJ Research PTC-100热循环仪中进行MJ Research, Waltham, MA,USA)PCR程序: 94°C 5分钟,其次是35周期为94°C 1分钟 ,在每个引物的退火温度为1分钟, 72°C 2分钟,和最后一个扩展72°C 10分钟。PCR产品1.5%琼脂糖凝胶上分离,用溴化乙锭染色的,在紫外光照射下拍摄。

2.3 TRAP分析

为了开发TRAP标记，从ESTs中筛选出12条固定引物，与s -腺苷-甲硫氨酸合成酶(SAMS)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、glycine max v型质子ATP酶16kda类蛋白脂亚基和knoted1类同源框蛋白基因同源。引物采用Primer Premier 5.0设计。本研究随机选取5个引物取自Li和Quiros(2001)。PCR扩增液为25 mu;L，包含1times; PCR buffer, 2.5 mM Mg² ， 0.3 mM dNTPs，正反向引物各0.4 mu;M, 1 U Taq DNA聚合酶(TaKaRa Bio.),和30 ng基因组DNA模板。PCR的扩增程序: 94°C 5分钟,紧随其后的是5个周期的 94°C 1分钟,35°C 1分钟, 72°C 1分钟,和35个周期的94°C 1分钟, 50°C 1分钟, 72°C 1分钟,最后在72°C扩展7分钟。PCR产品分离6%变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺:bisacrylamide 19:1), 然后如前所述，使用银序列DNA染色试剂(Promega, USA)进行染色。(Feng et al., 2013).

2.4数据分析

仅将重复性和一致性的SCoT和TRAP片段分为存在(1)和缺失(0)。SCoT和TRAP引物的多态性信息含量(PIC)按公式计算:

其中n是等位基因(标记)数量，qi是第i个等位基因频率，qj是第j个等位基因频率(Botstein et al.1980)。采用NTSYS-pc version 2.10e (Rohlf, 2000)软件进行聚类分析。以简单匹配系数(SM)计算的相似矩阵为基础，采用非加权算术平均配对组法(UPGMA)绘制树状图(Nei and Li, 1979)。采用Mantel测试评估SCoT和TRAP相似矩阵之间的相关性，该测试假设这些矩阵是独立获得的。利用主坐标分析(PCoA) (Gower, 1966)进一步证明了石斛属植物在散点图上的多维分布。

表2 22条SCoT引物的多态性信息。

*AT= *在=退火温度。

*Ntl = n u m b e r o f l o c i。

*Npl =多态位点数。

*Ppl =多态位点百分率。

*PIC =多态信息内容。

1. 结果

3.1 SCoT和TRAP多态性

利用36条SCoT引物对6种石斛的基因组DNA进行初始引物筛选，筛选出22条具有清晰、可重复多态性的SCoT引物，对石斛的遗传多样性进行评价。频带的数量和程度各引物显示的多态性见表2SCoT分析共获得337条显著条带，其中多态性条带324条。每个SCoT引物的多态性条带为11条(scot14,21) ~ 19条(SCoT33, 34, 35, 36)，平均为15.3条。引物多态性百分率为83.3% ~ 100%，平均多态性为96%。图中显示了一份代表性的资料(SCoT28)。各SCoT引物的PIC值变化范围为0.928 (SCoT14, 18) ~ 0.968 (SCoT33)，平均为0.953。对60对TRAP引物、12条固定引物组合和5条任意引物进行预筛选实验。共观察到510个条带，其中500个为多态性条带，范围从29个(De12/Em5)到45个(De3/Em6;每个引物组合的平均条带数和多态性条带数分别为39条和38条。多态频带百分比为90.6% ~ 100%，各物种间平均多态性为97.8%。使用De3/Em8组合获得的一个代表性剖面如图2所示。PIC值为0.978 (De9/Em8) ~ 0.987 (De4/Em6)，均值为0.983。

图1 引物SCoT28扩增谱。M巷:左边是长度(bp)的DNA分子标准。巷1 - 38:表1中38个石斛样品(1 - 38)的基因型。

图2 引物组合De3/Em8的TRAP扩增谱。M巷:左边是长度(bp)的DNA分子标准。巷1 - 38:表1中38个石斛样品的基因型。

表3 石斛属植物TRAP (targeted region amplified polymorphism, TRAP)引物特征分析。

从Li和Quiros(2001)中获得任意反向引物序列。

3.2石斛属植物种间的遗传关系

利用SCoT和TRAP生成的二值数据矩阵分别估计被测树属植物的遗传相似性。在种间水平，SCoT标记检测到的成对相似系数为0.55 (D. officinale (Y-2)/ aphyllum Dendrobium longicornu/Dendrobium williamsonii) ~ 0.81 (Dendrobium longicornu/Dendrobium williamsonii)， TRAP标记检测到的成对相似系数为0.57 (Dendrobium moniliforme/D)。(D. longicornu/ Dendrobium christyanum)。回归分析采用Mantel检验，比较SCoT和TRAP分析计算的相似系数矩阵。SCoT和TRAP标记与r = 0.48的相关性较低。为了获得更准确的遗传估计，将SCoT和TRAP标记产生的847个条带整合到一个基质中，对本研究测试的石斛种间的遗传关系进行评价。铁皮石斛(D. officinale (Y-2))/海南石斛(Dendrobium hainanense)的两两相似系数为0.59 ~ 0.84;williamsonii)种间水平。利用Mantel检验对SCoT与TRAP、SCoT和TRAP的积分得到的相似系数矩阵进行比较。SCoT与TRAP的相关系数均较高(r =

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

英语原文共 7 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[271439]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word