通过microRNA-15b调节人类成骨细胞的增殖和凋亡外文翻译资料

通过microRNA-15b调节人类成骨细胞的增殖和凋亡

摘要

小分子核糖核酸()在成骨细胞的增殖和分化中发挥重要着作用。我们最近的报道,miR-15b在成骨细胞分化中充当一个积极的监管机构，而它的功能在成骨细胞的增殖作用仍不清楚。在这项研究中,我们发现当他们是暂时性的转染时，人类成骨细胞的增殖细胞(MG63)充当miR-15b抑制剂。在G0/G1期相当水平的细胞群被发现，增加在S和G2 / M期miR-15b抑制剂治疗。细胞周期素E1——被发现有效目标基因miR-15b，miR-15b模仿和miR-15b抑制剂治疗细胞减少和分别增加了细胞周期蛋白E1表达式。我们进一步发现,细胞周期蛋白E13`UTR直接通过miR-15b使用荧光素酶报告基因系统有针对性。在“分离” MG63细胞miR-15b抑制剂没有发现显著的影响。因此,这些发现在miR-15b表达式作为负调节成骨细胞增殖的理解上提供新的见解。

关键词

miR-15b ；成骨细胞；增殖；细胞周期；细胞死亡；Cyclin E1

1. 介绍

小分子核糖核酸()非编码小内源性RNAs(sim;23nt)调节基因表达在转录后水平针对3 `UTR(翻译区)的mRNAs。他们共同控制几个生物和病理过程,包括细胞增殖、分化、生长、细胞周期、细胞凋亡代谢[1 - 5]。分析了miR-15b在不同类型的组织的几个miRNA的表达，其中包括成骨细胞[1,2,6-11]。之前报道过，miR-15b在不同成骨细胞的间充质干细胞(MSC) 的表达和功能作用。miR-15b报道在各种癌变细胞增殖,其监管属性、细胞凋亡、进展和神经元分化及其功能的作用可能依赖基于内部和外部环境系统[6-12]。 MSC分化成任何特殊细胞成骨细胞，包括细胞增殖、衰老、凋亡、分化和矿化矩阵的形成。负责上述事件的分子机制可能涉及通过激活几个像MAPK信号通路,TGF-B和BMPs，转化因素,生长因子和其他细胞因子和词素[2,13-15]。例如,细胞循环机制是由于细胞周期蛋白的蛋白质及其相关的细胞周期蛋白依赖激酶(CDKs)与不同的组合。除此之外,一些CDK的负调控Cip / Kip和p16的家族，据报道在不同的点履行下游细胞周期的影响机制。与各种信号分子,下游组件和其他监管机构,也决定了细胞进入细胞周期事件,反过来指导命运细胞增殖、衰老、凋亡和分化的可能1-3,13-15]。尽管我们最近解剖miR-15b在成骨细胞分化的功能作用,其作用在调节细胞增殖和细胞凋亡仍不清楚。因此,本研究是写给识别miR-15b在成骨细胞增殖和细胞凋亡的作用。

1. 材料和方法

2.1 细胞培养和转染

人类成骨细胞的细胞间充质(MG63)和老鼠干细胞(C3H10T1/2)培养和在这项研究中的应用[5]。miR-15b抑制剂(美国应用生物系统公司,CA:MH10904) 旨在结合内生miR-15b从而抑制它在细胞的活动。miR-15b模仿(应用生物系统公司:MC10904)旨在内生miR-15b相似。一个负控制miRNA(应用生物系统公司:4464076)也包括在内在这项研究中。转染,X-treme基因转染试剂(罗氏,曼海姆,德国)使用。在6 -细胞被播种好板1times;10 5细胞/ 2毫升每口井的生长介质。后达到60%的融合细胞受到miRNA转染。转染试剂与50 nM的混合，miR-15b抑制剂/模仿或消极控制miRNA和瞬变转染根据制造商的进行指令。

2.2 细胞计数、可行性、细胞周期和细胞凋亡

3天结束时瞬时转染的细胞使胰蛋白酶化进行细胞计数,生存能力,细胞周期阶段和细胞凋亡分析MuseTM(Merck-Millipore、孟买、印度) 自动化的细胞分析仪按照制造商的指示。细胞凋亡分析,Muse的收获细胞被染色膜联蛋白V和死细胞试剂(MCH100105)和孵化20分钟在室温和细胞凋亡。

2.3 实时RT-PCR

根据美国制造商的协议(表达载体,CA)从细胞总RNA分离试剂盒试剂和互补用逆转录酶合成装备。实时聚合酶链反应分析使用KAPA qPCR工具包(KAPA SYBR根据美国制造商的协议(表达载体,CA)快从细胞总RNA分离试剂盒试剂和互补用逆转录酶合成装备。实时聚合酶链反应分析使用KAPA qPCR工具包(KAPA SYBR快 美国马生物系统)。信使rna引物和内部控制,U6引物用于放大如表1所示。热循环简况如下：初始变性为5分钟，95℃,，其次是循40、95℃周期30秒，58℃、30秒和72℃、30秒, 最后一个扩展在72℃ 5分钟。相对mRNA表达式，计算通过使用Ct方法的相对量化。

2.4 西方墨点法

整个细胞溶解产物是准备使用缓冲区里帕(猫# R 美国密苏里州0278年，MO，USA)和20微克总蛋白质用于免疫印迹分析。发现带信号蛋白质通过添加超信号西方硬脑膜持续时间延长美国衬底(热科学、NH)根据开发- 真正的指示。图像被图像量化软件如前所述[17]。最早的和二次抗体是来自圣克鲁斯美国生物技术(CA)。

2.5 荧光素酶报告实验

荧光素酶报告基因分析是使用Pmir——执行，如果Dual-Luciferase miRNA的目标所述预先表达载体。野生型的引物3`UTR的细胞周期素E1 - 前进(5`AAACTAGCGGCCGCGAACTGTTTTGTAAGTGCTGCTAT3`)和反向(3`TTTGATCGCCGGCGCTTGACAAAACATTCACGAC-GATAGATC5`),和变异3`UTR细胞周期素E1的前进(5`AAACTAGCGGCCGCGAACTGTTTTGTAAGTGAAGCTAT3`)和反向(3`TTTGATCGCCGGCGCTTGACAAAACATTCACTTCGATAGATC5`)化学合成。这些正向和反向引物的野生或包含一个本地区——突变细胞周期素E1部分退火和克隆PmeI和XbaI之间，限制性位点出现在pmirGLO 双重的荧光素酶miRNA的目标表达载体(美国猫# E1330;Promega，USA)。克隆包含细胞周期素E1是否是3`UTR序列被确定NotI消化。暂时MG63细胞转染miR-15b 50 nM模仿,miR-15b抑制剂或消极控制miRNA200 ng野生或突变细胞周期素E13`UTR使用脂肪构造fectamine2000(表达载体转染试剂,猫# 11668 - 027)。转染24小时后,细胞收获与被动消散缓冲(PLB)和Fluroskan的荧光素酶活性测定多模读者(美国马Thermoscintific，MA，USA)使用双荧光素酶记录分析系统(Promega猫# E1910)。萤火虫荧光素酶活动规范化Renilla荧光素酶活性和所有擅长达进行了一式三份。

2.6 统计分析

所有数据被视为基于至少三个平均数plusmn;标准差复制为每个治疗。显著性差异(p lt; 0.05)团体之间是由学生的学习任务。

3结果与讨论

3.1 miR-15b减少人类成骨细胞的细胞扩散

我们之前的研究表明,表达miR-15b 期间显著调控msc分化的方向成骨细胞及其功能分析也强调,miR - 15 b包括在促进成骨细胞的谱系分化。按照细胞生理学、终止细胞pro-iferation是开始分化的特征。再为了识别miR-15b对成骨细胞增殖的影响,人类成骨细胞的细胞(MG63)细胞是暂时性的转染消极的控制microrna或miR-15b抑制剂和孵化3天。细胞被允许决定他们num-伯斯和百分比缪斯TM分析仪使用的可行性细胞计数和生存工具包(图1)。代表的细胞从一个显示了三个独立实验的可行性图1 a。之间没有改变在细胞生存能力控制加热器miRNA的转染细胞和miR-15b抑制剂转染细胞；而细胞num-有显著增加系统暂时当细胞转染miR-15b抑制剂。看来miR-15b抑制pro -的表达liferation的成骨细胞的细胞。几项研究已经强调了microrna在增殖和分化中的作用[18-20]；据报道,mir-92 b增加核扩散和减少肝祖细胞分化，miR-1和mir-499被发现减少核扩散和增加区别心肌细胞[22]。miR-26b抑制与众不同——被发现tiation通过促进脂肪细胞的增殖没有改变细胞凋亡[23]。

3.2 细胞周期调控miR-15b目标

细胞增殖的变更miR-15b抑制剂 可以通过调节细胞周期阶段改变导致的至关重要的细胞分裂和细胞凋亡的基因。调查的影响miR-15b分布在细胞周期阶段,MG63细胞反式- 与负面效应控制miRNA或miR-15b抑制剂, 进行细胞周期阶段分析[13-16]。结果表明,细胞转染与miR-15b抑制剂明显减少比例的细胞G0/G1期和增加的百分比年代和G2 / M期细胞与细胞转染。负控制miRNA。这些数据显示miR-15b表达式可能会抑制细胞的发展从G0/G1期S期。为了研究功能在细胞周期调节miR-15b过渡,生物信息学工具被应用于确定miR-的假定的目标15 b。许多基因在细胞周期相关的通路被DIANA-mirPath许多重要的细胞周期边条- 保守党的基因被米兰达。许多基因在不同Wnt信号通路(p53,TGF`、MAPK、细胞周期和细胞凋亡)是公认的目标miR-15b。

自从miR-15b抑制剂显著增加细胞数量以及细胞的百分比和G2/M期，我们想要确定细胞周期蛋白的表达参与细胞增殖。细胞周期素E1可能涉及在G1年代过渡阶段。细胞周期蛋白D1,而细胞周期蛋白D2和D3主要表达在细胞和一个复杂的形式CDK4/6在细胞质中,把核他们与CDK激活激酶(CAK)。一个主要的复杂自从miR-15b抑制剂显著增加细胞数量以及细胞的百分比和G2 / M期，我们想要确定细胞周期蛋白的表达参与细胞增殖。细胞周期素E1可能涉及在G1年代过渡阶段。细胞周期蛋白D1,而细胞周期蛋白D2和D3主要表达在细胞和一个复杂的形式CDK4/6在细胞质中,把核他们与CDK激活激酶(CAK)。一个主要的复杂。确定细胞周期蛋白基因的表达(s),MG63细胞暂时性的转染和消极控制miRNA miR-15b 抑制剂,总RNA是孤立和接受实时RT-PCR。没有改变mRNA的表达细胞周期蛋白A2,B1和D1 -控制miRNA或miR-15b抑制剂治疗在这些细胞条件;而有显著增加信使rna的表达细胞周期素E1。除了mRNA水平, 我们也决定细胞周期素E1蛋白水平的表达通过免疫印迹分析。与上面的结果是一致的，显示有增加细胞周期素E1蛋白的表达，当细胞被暂时性的转染miR-15b抑制剂; 而没有改变细胞周期蛋白D1的表达支持爱因斯坦-控制miRNA或者miR-15b抑制剂治疗。除了MG63细胞,小鼠间充质干细胞，细胞(C3H10T1/2)也暂时性的转染和消极控制miRNA miR-15b抑制剂或miR-15b模仿。完整的细胞溶菌产物是准备和接受免疫印迹分析细胞周期素E1蛋白。结果表明,细胞周期蛋白的表达E1蛋白被miR-15b模仿而显著减少，它是由miR-15b抑制剂显著增加。因此,结果表明,细胞周期蛋白E1可能是一个miR-15b的潜在功能的目标。其他人也报道 3＇UTR细胞周期素E1的信使rna直接miR-的目标15 b使用荧光素酶报告基因系统[6-10,26,27]。虽然细胞分化,似乎miR-15b 抑制细胞增殖的作用。

3.3 miR-15b直接目标3 ＇UTR成骨细胞的细胞周期素E1

直接确定miR-15b目标细胞周期素E1 3 ＇UTR, 双荧光素酶报告实验系统使用。Renilla荧光素酶基因存在于pmirGLO构造及其持续活跃活动可用于萤火虫荧光素酶活动的正常化。pmirGLO构造包含野生或突变的细胞周期蛋白E1 3＇UTR下游的萤火虫荧光素酶报告基因瞬变co-transfected miR-15b模仿,miR-15b 抑制剂或消极控制miRNA MG63细胞。pmirGLO 的构建包含突变的细胞周期素E1 3＇UTR没有明显不能改变荧光素酶活性miR-15b模仿, 抑制剂或消极的控制治疗;而pmirGLO构建包含野生细胞周期蛋白E13`UTR明显荧光素酶活性降低miR-15b模拟治疗比较与消极的控制或miR-15b抑制剂。因此,这个结果表明miR-15b可以直接目标3`UTR的细胞周期素E1成骨细胞信使RNA。这是别人所示一致在不同的系统[26、27]。

3.4 miR-15b调节成骨细胞的细胞凋亡

　　尽管miR-15b目标细胞周期素E1和抑制细胞增殖,诱导“分离”的可能性在成骨细胞上睑下垂miR-15b不能被排除。因此, 假定的目标基因和信号通路ini——网络对钛铝合金进行了分析。TarBase 6.0数据库提供了实验证明的目标miRNA[28]。所选择的候选人,miR-15b受到研究了通过实验验证的目标。从这个、BCL2 CCNE1、CCND1 EIF4A1、MAP2K4 ARL2,VEGFA CASP3 CASP8和CASP9被确定为目标进行验证。这些目标是进一步分析其内部和分子国米,国米动作和信号通路,ToppCluster网络分析仪[29]。miR-15b监管网-工作是由Cytoscape 3.0.1。网络显示相对大多数的val-idate

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