D-氨基酰化酶基因的克隆及其转化表达
一、课题简介及其背景
D-氨基酰化酶即N-酰基-D-氨基酸酰胺水解酶，它催化水解D-氨基酸的酰化衍生物得D-氨基酸，是分离消旋DL-氨基酸的一类重要水解酶类[1]。本课题通过设计合适的引物，运用PCR的手段，克隆得到D-氨基酰化酶基因，连接到合适的载体上，进行异源表达。通过此研究，希望能够获得高效稳定表达的D-氨基酰化酶，以便更好的应用于工业化生产。
非天然的D型氨基酸虽然不是构成蛋白质的基本结构单元，但许多植物、微生物和高等植物中都有D-氨基酸的存在。D-氨基酸在各个领域都有广泛的应用[2-4]。
1. 医药方面。用于合成多肽药物，如多肽抗生素，肠胃药，利尿药，腹泻药（善得定SANDOSTATIN ACETATE），酶抑制剂，促皮质素类似物，止痛镇痛药，减肥药，Ⅱ型糖尿病治疗药（那格列奈NATEGLINIDE）等。
2. 食品方面。天苯二肽（阿斯巴甜），天丙二肽（阿力甜）等新型甜味剂。
3. 农药方面。氨基酸农药无需大面积使用，不但可减少人力物力和药用量，且具有毒性低、高效无公害，易被降解利用，原料来源广泛等特点，成为新型农药研究热点。
4. 科学研究。通过研究生物体内氨基酸D，L型异构体含量的改变，可作为年代记时器进行气候、水文研究。D型氨基酸还可用于酶结构功能分析方面的研究。
产D-氨基酰化酶的菌株首先由Kameda等在1952年从土壤中分离得到，此后一直到70年代末才出现对该酶的报道。人们对D-氨基酰化酶的了解远不如对L-氨基酰化酶的了解深，D-氨基酰化酶的生理作用至今还不清楚，包括水解机制，结构与催化作用间的关系，以及酶活性的调节机制等等。D-氨基酰化酶首先在木糖氧化产碱杆菌（Alcaligenes xylosoxydans subsp.xylosoxydans）中得到克隆及测序，除木糖氧化产碱杆菌外，目前已报道的D-氨基酰化酶的DNA序列还有粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）、争论产碱菌（Variovorax paradoxus）等[5-9]。由于 D-氨基酰化酶对于D-氨基酸生产至关重要，因此对于D-氨基酰化酶的理论研究及实际应用都还有许多工作要做。
