扭链瘤胃球菌中的一种新型7β-羟基类固醇脱氢酶用两步酶法合成熊去氧胆酸外文翻译资料

扭链瘤胃球菌中的一种新型7beta;-羟基类固醇脱氢酶用两步酶法合成熊去氧胆酸

作者：Ming-Min Zheng^a, Ru-Feng Wang^c, Chun-Xiu Li^a, Jian-He Xu^a，b

单位：a. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, PR China

b. Shanghai Collaborative Innovation Center for Biomanufacturing, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, PR China

c .Department of Pharmacognosy, China Pharmaceutical University, Nanjing 210038, PR China

摘要：

7beta;-羟基类固醇脱氢酶(7beta;-HSDH)是有效合成熊去氧胆酸(UDCA)的关键酶，熊去氧胆酸是治疗原发性胆汁性肝硬化和人胆固醇结石的有效药物。本研究从扭链瘤胃球菌（Ruminococcus torques）ATCC 35915中分离到一个新的7beta;-HSDH，命名为7beta;-HSDH_Rt，并在大肠杆菌中异源高效表达，用于鹅去氧胆酸的酶法合成熊去氧胆酸。首次将7beta;-HSDH_Rt与 7alpha;-HSDH_Ca（另一种来自苦味梭菌（Clostridium absonum）中的NADPH依赖型7alpha;-HSDH），以一锅法将CDCA转化为UDCA，而不需要额外的辅酶再生。然而，最终的收率仅为73%，这可能是由于化学平衡的原因。因此，为了提高UDCA的产率，我们交替采用了两步反应策略，即在第一步反应(脱氢)和第二步反应(氢化)之间对参与第一步反应的酶进行简单的热灭活，以防止第二步反应中7-oxo-LCA被不需要的生物还原作用还原为CDCA。结果，在底物负载量为10 mM(约4gL^minus;1)时，UDCA的分析收率可显著提高到98%以上，且不存在一锅反应中可检测到的中间体(7-oxo-LCA)。

关键词：熊去氧胆酸；鹅去氧胆酸；7alpha;-羟基类固醇脱氢酶；7beta;-羟基类固醇脱氢酶；两步反应

1.引言

动物胆汁作为一种传统中药，具有重要的药用功能和独特的临床应用价值[1]。胆汁酸的结合物和盐是胆汁的天然产物和基本成分，在人体脂肪代谢途径中起着重要作用[2]。熊去氧胆酸(UDCA)是一种内源性胆汁酸，具有溶解胆石酸、改善肝脏植入、治疗反流性胃炎、胆源性胰腺炎、酒精性肝、原发性胆汁性肝硬化和药物性肝炎等多种药用价值[3]。UDCA通常是从牛和鹅胆汁中提取出来的同分异构体鹅去氧胆酸(CDCA)通过7-OH构型转化的化学反应获得。

在该方法中，CDCA在N-溴代丁二酰亚胺或其他弱氧化剂[5]的作用下完全转化为7-氧代-LCA，然后在氮气保护下加入硼氢化钠或硼氢化钾得到熊去氧胆酸粗品。最后加入氯仿提纯UDCA[6]。由于反应过程复杂，选择性低，UDCA的总收率很低，限制了其工业化生产[7]。与化学差向异构化相比，CDCA生物合成UDCA温和、环保。

在体内，UDCA是由肠道中的短链脱氢酶(SDR)超家族中的羟基类固醇脱氢酶(HSDHs)作用合成的[8，9]。因此，分离的肠道细菌将CDCA转化为UDCA已被广泛研究。利莫氏梭菌(Clostridium Limosum)[10]、苦味梭菌（Clostridium absonum ）[11]、巴拉氏梭菌(Clostridium Baratii)[12]和嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas Maltopophia)[13]已被用来实现CDCA向UDCA的异构化。利用产气真杆菌(Eubacterium aerofaciens）和脆弱类杆菌（Bacteroides fragilis）的混合培养也实现了异构化[14]。然而，高浓度的CDCA抑制了细胞的生长[11]。另外，HSDH催化的反应是可逆的，底物的高转化率受到限制，导致产物回收和提纯困难。此外，以前的研究表明，随着培养时间的延长，中间体的产率增加，UDCA减少[15，16]。7alpha;-HSDH(EC1.1.1.159)和7beta;-HSDH(EC1.1.1.201)是CDCA生物转化为UDCA的两个关键酶。从真细菌(Eubacterium sp )[17]、大肠杆菌(Escherichia coli )[18]、索氏梭菌(Clostridium Sordellii)[19]、脆弱类杆菌(B.Fragilis)[20]和苦味梭菌(C.abonum)[21] 中克隆了编码7alpha;-HSDH的基因。其中，从大肠杆菌中分离得到的7alpha;-HSDH，其晶体结构已确定，其将CDCA转化为UDCA的活性最高[22]。相比之下，7beta;-HSDH的可用信息要少得多。到目前为止，只有3个编码7beta;-HSDHs的基因被克隆出来，它们分别来自苦味梭菌（C. absonum） [21]、产气柯林塞氏菌（Collinsella aerofaciens ） [23]和活泼瘤胃球菌（Ruminococcus gnavus） [24]。因此，有必要寻找更多更好的7beta;-HSDH来高效合成UDCA。在此，我们报道了一个新的高活性7beta;-羟丁酸脱氢酶，它的基因被成功地从扭链瘤胃球菌（Ruminococcus torques）爱他、ATCC 35915中克隆出来，并在大肠杆菌中进行了异源表达。对其进行了纯化，并对其酶学性质进行了鉴定。

同时，我们描述了利用7alpha;-HSDH和7beta;-HSDH在一锅中通过连续的两步反应将CDCA生物转化为UDCA(图2)。在氧化步骤中，CDCA在7alpha;-HSDH催化下被氧化成7-氧代石胆酸(7-oxo-LCA)。辅因子(NAD ⁾与乳酸脱氢酶(LDH)和丙酮酸的再生偶联。类似地，7beta;-HSDH在还原步骤中催化葡萄糖脱氢酶(GDH)和葡萄糖催化7-氧代石胆酸还原为UDCA，以再生辅因子(NADPH)。7alpha;-HSDH和乳酸脱氢酶在第二步反应前通过加热失活，避免可逆反应，以提高UDCA的收率。

图 1CDCA(1)一步级联反应合成UDCA(3)

2.材料和方法

2.1. 材料

用于基因组挖掘的微生物菌株来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物与细胞培养保藏中心(DSMZ)和中国通用微生物培养保藏中心(CGMCC)。大肠杆菌DH 5alpha;和大肠杆菌BL21(DE3)作为克隆和表达宿主，在Luria-Bertani(LB)培养基中培养。

NADH依赖型的7alpha;-羟基类固醇脱氢酶(7alpha;-HSDH，EC 1.1.1.159)来自大肠杆菌， NADPH依赖型的7alpha;-羟基类固醇脱氢酶来自苦味梭菌（C. absonum ）DSM 599[21]，乳酸脱氢酶(LDH，EC 1.1.1.27)来自德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus）DSM 20081[25]，和来自芽孢杆菌（Bacillus megaterium）的葡萄糖脱氢酶(GDH，EC 1.1.1.47)在重组大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达。鹅去氧胆酸(CDCA；3alpha;，7alpha;-二羟基-5beta;-胆甾烷-24-酸)和熊去氧胆酸(UDCA；3alpha;，7beta;-二羟基-5beta;-胆甾烷-24-酸)购自上海思宇化工科技有限公司。7-氧代-石胆酸(7-oxo-LCA；3alpha;-羟基-7-氧代-5beta;-胆甾烷-24-酸)购自上海迈瑞尔化工技术有限公司。这项工作中使用的所有其他化学品都是从商业来源获得的，并且是试剂级或更好的质

2.2.7beta;-HSDH_Rt基因的克隆、表达和纯化

扭链瘤胃球菌（Ruminococcus torques）ATCC 35915的基因组DNA用来自天根（中国上海）的TIANamp细菌DNA试剂盒来提取和纯化。用带有BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的引物，聚合酶链反应(PCR)扩增含有7beta;-HSDH_Rt基因的DNA片段。将得到的质粒转入大肠杆菌DH5alpha;用于放大。用标准方法提取质粒，转入大肠杆菌BL21(DE3)。

在含50mu;gmL^-1卡那霉素的LB培养基中，37℃培养，当OD₆₀₀达到0.6~0.8时，加入终浓度0.2 mM的异丙基-D-1-硫代半乳糖苷。在16℃培养24h后，8800times;g离心10min，用生理盐水洗涤。将细胞重新悬浮在缓冲液A(20 mM磷酸钠缓冲液，pH7.4,500 mM NaCl和10 mM咪唑)中，用超声波振荡器(JY92-II，Science z Biotech Co.)超声破碎。细胞裂解液以12.000times;g离心20min，上清液过滤后装入Ni-NTA柱(5mL，GE Healthcare Co.) 用缓冲液A平衡，缓冲液A预洗后，在缓冲液A中以线性梯度洗脱10~500 mM咪唑，洗脱时间为5mL min^minus;1。用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定其纯度。收集含有7-羟基类固醇脱氢酶(7beta;-HSDH)活性的组份，用磷酸钠缓冲液对其进行广泛透析，以去除高浓度的咪唑和盐。

2.3.蛋白质分析

用分光光度法在波长340nm(ε=6.22 mM^minus;1 cm^minus;1)和30℃下，通过测定NAD(P)H的氧化或NAD(P) 的还原来测定酶的活性。

标准混合物(1mL)：(a)NAD(P)依赖7-HSDH测定：0.1 mM NAD(P) ，1 mM CDCA加入0.1M磷酸盐缓冲液中，pH 8.0；(b)7-HSDH_Rt测定：0.1 mM NADP(H)，1 mM 7-oxo-LCA(或UDCA)，加入0.1M磷酸盐缓冲液中，pH 6.5(或8.0)；(c)LDH测定：0.1 mM NADH，1 mM丙酮酸钠，加入0.1M磷酸盐缓冲液中，pH 8.0；(d)GDH测定：0.1 mM NADP ，1 mM葡萄糖，加入 0.1M磷酸盐缓冲液中，pH 6.5，适量酶。一个活性单位的定义是在所用的测定条件下，每分钟催化还原(或氧化)1mol NAD(P)(H)的酶量。

2.4.纯化的7beta;-HSDH_Rt的性质

在磷酸盐缓冲液(100 mM，pH6.5)中，在2 0~5 0℃范围内，测定不同温度下7beta;-HSDH_Rt活性，以确定温度对7beta;-HSDH_Rt活性的影响。在不同的pH值(正向反应为5.0-9.0，反向反应为6.5-10.5)下，用标准活性测定法确定了最适pH。将纯化的酶(1.0mgmL^-1)在相同的磷酸盐缓冲液(100 mM，pH6.5)中分别在30℃、40℃和45℃下处理，并测定不同时间的残余活力，确定了7beta;-HSDH_Rt的热稳定性。将纯化后的酶(1.0mgmL^-1)分别在磷酸盐缓冲液(100 mM，pH6.5)、磷酸盐缓冲液(100 mM，pH8.0)和甘氨酸-氢氧化钠(100 mM，pH10.0)中30℃处理，测定不同时间的残余活力，确定7beta;-HSDH_Rt在不同pH条件下的稳定性。

用Microsoft-Excel2010进行非线性拟合，确定了7beta;-HSDH_Rt在两个方向上的动力学参数。底物7-氧代-石胆酸的浓度分别为0.008 mM、0.01 mM、0.015 mM、0.02 mM、0.025 mM、0.05 mM、0.1

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