1. 研究目的与意义、国内外研究现状(文献综述)
通过研究hops专一性亚基与自噬相关蛋白间的相互作用来探讨hops调控产生自噬体和内体与自噬相关蛋白之间的联系。
自噬体是一种溶酶体依赖性的细胞内降解途径,主要将生物大分子回收至溶酶体中并将其降解为单糖、氨基酸等小分子。
在酵母当中,酵母的液泡等同于哺乳动物的溶酶体系统。
2. 研究的基本内容和问题
hops专一性蛋白是否与自噬相关蛋白产生互作。
研究hops中vps39、vps41这两个蛋白与atg6、atg14、vps34、vps38、vps15这几个自噬相关蛋白间的相互作用。
关键问题是将vps39和vps41克隆到质粒上,并将重组质粒转化到y187酵母中,并分别同含有atg6、atg14、vps34、vps38、vps15的y2hgold酵母进行酵母双杂交以检测是否有互作,并验证目的蛋白是否能够在酵母当中表达。
3. 研究的方法与方案
主要研究方法是pcr,酶切酶连,电转化,酵母转化,酵母双杂交。
技术路线:1、pcr扩增目的基因,并将产物和质粒进行酶切酶连后,获得重组质粒。
(2014.9-2014.10)2、通过电转化将重组质粒转入大肠杆菌,通过菌落pcr挑选含目的基因的菌落用以提取质粒。
4. 研究创新点
特色是通过酵母双杂交技术来研究蛋白质间的互作,Vps39、Vps41这两个蛋白与Atg6、Atg14、Vps34、Vps38、Vps15这几个自噬相关蛋白间的相互作用还未有人验证过。
5. 研究计划与进展
2014.09-2014.10:完成目的基因扩增,以及重组质粒的构建。
2014.10-2014.11:完成电转化,菌落pcr,提取重组质粒。
2014.11-2014.12:将提取的质粒进行酶切验证和测序,酵母转化2014.12-2015.01:荧光观察2015.01-2015.02:酵母双杂交2015.02-2015.04:western blot每项步骤都有充足的时间进行,预期按期完成。
