一株琼脂降解菌的分离、鉴定与生化特性的研究开题报告

涂布于LB平板，30℃倒置培养，挑取不同类型典型单个菌落。观察平板的凹陷情况，挑取具有降解琼脂能力的菌。

2.2 琼脂降解菌的纯化

将挑选的菌株进行梯度稀释涂布，挑取降解能力好单菌落培养，经平板多次纯化后保存菌株。

2.3 琼脂降解菌的16sDNA鉴定

2.3.1提取琼脂降解菌的基因组DNA

1）新鲜菌株L-4接种于LB液体培养液培养，30℃、200rmin^-1，培养16~18 h。

2）取2ml菌液于2ml 离心管中，12000rmin^-1离心1分钟，弃去上清。

3）加入1ml TEN重悬，12000rmin^-1离心1分钟，弃去上清，用1ml TEN重悬菌体

4）加入100μl 10% SDS和10μl 20mgml^-1的蛋白酶K（100μgml^-1），混匀，于55℃温育至澄清。

5）加入370μl 饱和NaCl，剧烈震荡15s，12000g离心5min。

6）取上清液至新离心管中，加入等量体积的氯仿/异戊醇（24:1），混匀，12000rmin^-1离心5min，将上清转入新管，重复上述操作一次。

7） 加入0.6倍体积的异丙醇或两倍体积的乙醇（-20℃保存），轻轻混合直到DNA沉淀下来，12000rmin^-1离心10min，弃上清。

8）收集DNA沉淀，用75%乙醇（1ml）12000rmin^-1离心5min弃上清，重复一次，洗涤DNA沉淀，真空干燥至DNA变透明。

9）用50μl无菌水溶解DNA，-20℃保存。

2.3.2 琼脂降解菌16sDNA的PCR扩增

1）引物选择：通用引物27f和1492r

2）PCR扩增体系：

l0Buffer 5μl

Taq DNA 聚合酶（5Uμl ^-1） 0.5μl

MgCl₂（25 mmolL ^-1） 3μl

引物（5μ molL ^-1） 各1μl

模板（细菌DNA） 1μl

dNTPs（2.5 mmolL ^-1） 8μl

无菌水 30.5μl

3）PCR扩增条件

94℃预变性5min，进入热循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环，72℃5min。

2.3.3 TA克隆和蓝白斑筛选

1）选取TAKARA公司的pMD19-T载体，16℃链接2小时。

酶连体系：

载体 0.5μl

PCR产物 4.5μl

SolutionI 5μl

2）从-70℃冰箱中取出感受态细胞DH5α，放在冰水混合物中融化。

3）将链接产物全量加入感受态细胞中，冰浴30min。

4）42℃热击90s，放置冰水混合物中2min。

5）加入890μl SOC培养基 37℃、220rmin^-1，复苏1小时。

6）吸取100μl涂布在含有X-gal和Amp的LB平板上，37℃培养18h。

7）挑取白斑，放入LB试管中37℃、220rmin^-1，18h。

2.3.4 菌液PCR

方法和上述PCR一样，电泳检测后选取有片段的试管进行测序

2.4菌株的形态学特征

2.4.1菌落形态：

将菌株L-4划线接种到LB平板上，30℃培养24h，观察其平板上的菌落大小、形状、表面、边缘、隆起形状、透明度、湿润或干燥、光滑或粗糙、菌落及培养基的颜色等。

2.4.2个体形态：

革兰氏染色：挑取18~24h菌株纯培养物于载玻片上的无菌水中，干燥后火焰固定，滴加适量结晶紫染色lmin，水洗，滴加卢哥氏碘液媒染lmin，水洗，95％乙醇脱色30s，立即水洗，番红复染5min，水洗，晾干，镜检，同时以金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌为对照，油镜下观察。

2.5 生长曲线测定

1）从平板上挑取单菌落置于LB培养基中培养18h。

2） 吸取100μl菌液分别加入到17个含10ml LB培养基的50ml的三角瓶中，30℃、200rmin^-1培养。

3）从0开始每隔2小时取一次样，共32小时。

4）测定菌液OD₆₀₀。

2.6 初始pH对生长的影响

1）从平板上挑取单菌落置于LB培养基中培养18h。

2） 吸取100μl菌液分别加入到pH4，pH5，pH6，pH7，pH8，pH9，pH10的 LB培养基中，30℃、200rmin^-1培养。

3）30h后测定菌液OD₆₀₀。

2.7初始盐浓度对生长的影响

1）从平板上挑取单菌落置于LB培养基中培养18h。

2） 吸取100μl菌液分别加入到Nacl浓度为0，0.5g/L，1g/L，2g/L，3g/L，5g/L，10g/L的LB培养基中，30℃、200rmin^-1培养。

3）30h后测定菌液OD₆₀₀。

2.8温度对生长的影响

1）从平板上挑取单菌落置于LB培养基中培养18h。

2） 吸取100μl菌液分别加入到温度为20℃，25℃，28℃，30℃，37℃，40℃的LB培养基中，30℃、200rmin^-1培养。

3）30h后测定菌液OD₆₀₀。

2.9碳源的利用

1）从平板上挑取单菌落置于LB培养基中培养18h。

2） 吸取100μl菌液分别加入到碳源为乳糖，可溶性淀粉，葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，甘露醇，甘油的培养基中，30℃、200rmin^-1培养。

3）30h后测定菌液OD₆₀₀。

2.10氮源的利用

1）从平板上挑取单菌落置于LB培养基中培养18h。

2） 吸取100μl菌液分别加入到氮源为(NH4)₂SO₄，KNO₃，尿素，蛋白胨的培养基中，30℃、200rmin^-1培养。

3）30h后测定菌液OD₆₀₀。

2.11 C/N比对生长的影响

1）从平板上挑取单菌落置于LB培养基中培养18h。

2） 吸取100μl菌液分别加入到C/N为1/1,1/2,1/5,1/10,1/15的培养基中，30℃、200rmin^-1培养。

3）30h后测定菌液OD₆₀₀。

4.可行性分析

本试验采用土壤分菌，实验技术成熟，实验室相应的设备基本都具备所以可行性较高，从设计的各角度看也是切实可行的。

2.7初始盐浓度对生长的影响

1）从平板上挑取单菌落置于LB培养基中培养18h。

2） 吸取100μl菌液分别加入到Nacl浓度为0，0.5g/L，1g/L，2g/L，3g/L，5g/L，10g/L的LB培养基中，30℃、200rmin^-1培养。

3）30h后测定菌液OD₆₀₀。

2.8温度对生长的影响

1）从平板上挑取单菌落置于LB培养基中培养18h。

2） 吸取100μl菌液分别加入到温度为20℃，25℃，28℃，30℃，37℃，40℃的LB培养基中，30℃、200rmin^-1培养。

3）30h后测定菌液OD₆₀₀。

2.9碳源的利用

1）从平板上挑取单菌落置于LB培养基中培养18h。

2） 吸取100μl菌液分别加入到碳源为乳糖，可溶性淀粉，葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，甘露醇，甘油的培养基中，30℃、200rmin^-1培养。

3）30h后测定菌液OD₆₀₀。

2.10氮源的利用

1）从平板上挑取单菌落置于LB培养基中培养18h。

2） 吸取100μl菌液分别加入到氮源为(NH4)₂SO₄，KNO₃，尿素，蛋白胨的培养基中，30℃、200rmin^-1培养。

3）30h后测定菌液OD₆₀₀。

2.11 C/N比对生长的影响

1）从平板上挑取单菌落置于LB培养基中培养18h。

2） 吸取100μl菌液分别加入到C/N为1/1,1/2,1/5,1/10,1/15的培养基中，30℃、200rmin^-1培养。

3）30h后测定菌液OD₆₀₀。

4.可行性分析

本试验采用土壤分菌，实验技术成熟，实验室相应的设备基本都具备所以可行性较高，从设计的各角度看也是切实可行的。