反硝化细菌Bacillus sp. CZDM1催化新型抗生素单甲基砷(MAs(III))厌氧脱甲基过程开题报告

 2022-01-31 21:47:20

1. 研究目的与意义、国内外研究现状(文献综述)

砷(as)是全球分布广泛的一种有毒类金属,带来的土壤污染、土体污染等问题不容忽视,人类活动如砷开采、金属冶炼、含砷除草剂过度使用等,导致稻田土壤受到严重的砷污染 [1]导致稻米中砷含量超标。水稻在我国粮食生产中占据了重要位置,中国超过60%的人口以稻米作为主食[2],因此,稻米砷污染对人体健康造成潜在威胁[3]

水稻土中的砷形态多样,主要包括无机三价(as(iii))、无机五价砷(as(Ⅴ))、以二甲基砷(dmas)为主的有机砷以及少量的挥发性胂(图1),而稻米中砷主要以as(iii)及dmas形态存在。不同形态的砷毒性也不同,一般来说,无机砷的毒性往往大于有机砷,但也有研究发现三价态的有机砷(mas(iii))毒性比无机砷高数倍[4]。好氧条件下,水稻土中主要以无机as(v)为主,as(v)吸附于铁锰矿物和氧化铝矿物表面;淹水后,as(v)被还原释放转化为as(iii),由于铁氧化物对as(iii)吸附能力弱,因此,因此as(iii)具有更强的移动性和生物可利用性。近来有研究发现在单甲基三价砷mas(iii)通过生物转化生成,再由其体内的外排酶排出的过程中,由于mas(iii)的毒性较高,微生物可以利用mas(iii)杀死其周边微生物,从而达到生长优势,这与抗生素的机理类似,因此被研究者认为是一种新型抗生素[5]。但是,通过长时间的进化导致部分微生物对mas(iii)也产生了一定的耐性,菌株将mas(iii)外排或者将其转化为低毒砷化物的过程实现了其对mas(iii)的耐药性。这些过程包括:arsp及arsk介导mas(iii)的外排过程[6、7],arsh介导的mas(iii)的氧化过程[8]以及arsi催化mas(iii)的脱甲基过程。其中arsi催化mas(iii)的脱甲基过程是将mas(iii)转化为无机砷的过程,该过程除了降低mas(iii)的毒性外,也实现了有机砷到无机砷的转化过程,在砷的生物地球化学过程中发挥着重要的作用。

2011年yoshinaga等研究发现佛罗里达高尔夫球场土壤某种微生物可将mas(v)脱甲基成as(iii),并发现mas(v)需还原为mas(iii)后才能被脱甲基,因此mas(iii)是脱甲基真正底物。研究者进一步分离提取出可将mas(v)还原为mas(iii)的菌株burkholderiasp. mr1和可将mas(iii)脱甲基为as(iii)的菌株streptomycessp. md1,将两种菌株混合培养后可以进行完全的还原和脱甲基化[9],yoshinaga等在2014年又分离出一株具有mas(iii)脱甲基能力的菌株bacillussp. czdm1,并在该菌株的基因组内鉴定到了功能基因arsi[10]。pawitwar等[11]利用等温滴定量热、化学修饰,定点突变,荧光检测等检测方法揭示了arsi的酶学特性。关于mas(iii)在好氧条件下脱甲基过程及机理的研究已较深入,但是在厌氧环境下,mas(iii)脱甲基途径依旧未知。针对这一空白,本研究旨在探究参与淹水水稻土中mas(iii)的脱甲基过程及可能的机制。研究前期在厌氧条件下从水稻土中分离出一株具有mas(iii)脱甲基能力的反硝化菌株bacillussp. czdm1,并从其体内克隆出催化该过程的功能基因bcarsi。本研究试图在厌氧条件下从水稻土中分离出具有mas(iii)脱甲基能力的反硝化菌株bacillussp. czdm1,并阐明厌氧条件下菌株bacillussp. czdm1参与mas(iii)脱甲基的机制。研究有望揭示厌氧条件下新型抗生素mas(iii)的解毒机制,同时脱甲基途径涉及到了有机砷向无机砷的转化,因此也能补充厌氧生境中砷的生物地球化学循环。

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2. 研究的基本内容和问题

1 研究目标

明确厌氧条件下菌株bacillus sp. czdm1体内bcarsi催化新型抗生素mas(iii)的脱甲基过程与反硝化过程耦合。

2 研究内容

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3. 研究的方法与方案

1 研究方法及实验方案

1.1 本研究所用主要试剂

合成MAs(III)所用试剂及配方:

溶液A:吸取0.272 mL浓硫酸并定容至5mL

溶液B:称取1.241 g五水合硫代硫酸钠定容至5 mL

溶液C:称取0.95505 g焦亚硫酸钠定容至5 mL

溶液D:20 mM MAs(V)溶液

1 mM MAs(III)合成体系(50 mL):

溶液A(1.35 mL) 溶液B(3.30 mL) 溶液C(4.10 mL) 溶液D(2.50 mL),最后采用NaOH调节pH至6.0。

表1 菌株Bacillussp.CZDM1所用培养基成分

基本培养基成分

NaCl 1.17 g L-1, MgCl2·6H2O 0.4 g L-1, KCl 0.3 g L-1, CaCl2·2H2O 0.15 g L-1, NH4Cl 0.27 g L-1, KH2PO40.20 g L-1, Yeast extract 1 g L-1, NaHCO32 g L-1, 20mM NaNO3(电子受体), 20 mM succinate (电子供体).

微量元素符合液(1000×)

FeCl2·4H2O 2g L-1, ZnCl2·0.07 g L-1, MnCl2·4H2O 0.1 g L-1, CuCl2·2H2O 0.002 g L-1, NiCl2·6H2O, 0.024 g L-1, H3BO30.06 g L-1, CoCl2·6H2O 0.19 g L-1, Na2MoO40.036 g L-1.

维生素复合液(100×)

Biotin 2mg L-1, Folic acid 2 mg L-1, Pyridoixine-HCl 10mg L-1, Thiamine-HCl·2H2O 5mg L-1, Riboflavin 5 mg L-1, Nicotinic acid 5 mg L-1, D-Ca-pantothenate 5 mg L-1, Vitamin B12 0.1 mg L-1, p-Aminobenzoic acid 5 mg L-1, Lipoic acid, 5 mg L-1.

1.2菌株Bacillussp. CZDM1的分离筛选和MAs(III)抗性检测

本研究在厌氧反硝化条件下采用滚管技术从郴州(CZ)砷污染水稻土中分离筛菌菌株。通过分析该菌株的16S rRNA基因序列并与前期分离得到的Bacillussp. CZDM1菌株基因序列作比较,确定分离得到同种微生物。同时为了探究该菌株对MAs(III)的抗性,本研究在培养菌株的同时向其中添加不同浓度的MAs(III),浓度梯度为0,2,4,6,10 μM。菌株培养选用的培养基具体配方见表1,待菌株培养36小时后,取样测定菌株的OD600nm并进行分析。

1.3发酵条件下菌株Bacillussp. CZDM1的MAs(III)的脱甲基能力检测

在厌氧发酵条件下培养菌株,并添加2 μM MAs(III)。发酵选用基础培养基与反硝化培养基一致,将碳源更换为葡萄糖并不添加电子受体。在菌株培养过程中,采用注射器定时收集2 mL培养液,其中1 mL培养液直接用于分析OD600nm,剩余部分离心并过0.22 μm的滤膜,样品经稀释后用于分析其中砷形态、硝酸根(NO3-)、亚硝酸根(NO2-)。砷形态分析采用HPLC-ICP-MS (Perkin Elmer, USA),NO3-及NO2-采用比色法分析。

1.4反硝化条件下菌株Bacillussp. CZDM1的MAs(III)的脱甲基能力检测

若发酵条件下菌株MAs(III)不具备MAs(III)的脱甲基能力,则将发酵培养后的菌株全部转移到反硝化培养基中,验证其MAs(III)脱甲基能力能否恢复。具体操作如下:首先发酵培养该菌株并向其中添加2 μM MAs(III)。待培养48小时后,在厌氧手套箱中将菌体全部离心收集,并全部转接至反硝化培养基中,同时添加2 μM MAs(III),继续培养48小时。在培养过程中每隔24小时取样分析其中砷形态。

1.5发酵及反硝化条件下arsI基因的表达

在发酵(反硝化)条件下培养该菌株,待菌株培养48小时后,离心收集菌体并提取菌体总RNA,将菌体总RNA反转录成cDNA,并以该cDNA为模板采用荧光定量PCR来检测该培养条件下菌株体内arsI基因是否表达。在定量之前,根据基因组中鉴定到的arsI基因序列来设计特异性引物,同时选择该菌株基因组内促旋酶的B单位(gyrB)基因作为内参基因来进行定量。

1.6 N18O3-稳定同位素示踪试验

菌株培养时以N18O3-代替NO3-,同时以添加未标记的NO3-作为对照处理。为了减少同位素试剂用量,本研究将菌株培养体系缩小至2.5 mL,该试验共设计3个的处理:培养基 NO3- MAs(III)、培养基 N18O3- MAs(III)、菌株 NO3- MAs(III)、菌株 N18O3- MAs(III),每个处理设置3个重复。待菌株培养48小时后,收集样品并分别利用HPLC-ESI-MS/MS (Agilent 1200 series HPLC and a G6410B triple quadrupole mass spectrometer)及HPLC-ICP-MS分析其中砷形态.

2 技术路线

3 可行性分析

(1)项目开始前已取得部分研究成果,为本项目提供了理论基础。实验室在厌氧条件下从湖南郴州砷污染土壤中分离得到一株能将MAs(III)脱甲基的反硝化菌株,且在该菌株体内鉴定到一个与典型ArsI相似的BcArsI蛋白,并且通过异源表达证明BcArsI在厌氧反硝化条件下依然具有MAs(III)的脱甲基能力。同时前期好氧实验结果证明ArsI催化MAs(III)脱甲基过程需要消耗O2,为本研究中厌氧条件下NO3-可以代替O2完成由ArsI介导的MAs(III)脱甲基过程的假说提供了可能性。

(2)实验室有很多优秀前辈研究砷污染相关课题,为实验操作指导和项目思路提供了帮助。本人曾参加主持过大学生创业创新项目(SRT),对实验原理和基本操作有一定了解。

4. 研究创新点

(1)首次在厌氧条件下分离鉴定出一株具有MAs(III)脱甲基能力的反硝化菌株Bacillussp. CZDM1。

(2)ArsI依旧参与厌氧条件下MAs(III)的脱甲基过程,且NO3-可代替O2实现ArsI催化MAs(III)脱甲基过程。

5. 研究计划与进展

2019年12月- 2020年3月

(1)阅读砷污染及砷脱甲基化相关文献资料,了解已有研究结果;

(2)完成菌株bacillus sp. czdm1在厌氧发酵条件及发酵转反硝化条件下mas(iii)脱甲基能力检测;

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