不同源有机肥施用对土壤抗生素抗性基因丰度的影响开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

抗生素被大量应用在养殖业中，用于治疗疾病和促进生长，但抗生素在畜禽肠道内会诱导出耐药菌株，同时大部分抗生素难以被充分吸收利用，因此耐药菌和未被代谢的抗生素（25%～70%）并随排泄物排出^[1]。目前已在多家养殖场的粪便中检出多种高浓度的兽用抗生素，随着畜禽粪便施入土壤，其中的抗生素会显著刺激抗生素抗性基因（args）丰度升高^[2]，如在长期施用牛粪和鸡粪的温室土壤中，抗生素残留量与args丰度显著正相关^[3]。也有研究发现，动物种类对畜禽粪便和施粪肥土中抗生素抗性基因的多样性和丰度均有影响，如在施用最为广泛的三种粪肥类型中，粪便中args丰度由高到低的顺序依次为猪粪、鸡粪、牛粪^[4]；不同养殖场土壤样品中 args 的丰度表现为养猪场和养鸡场高于养牛场，这可能与养殖不同动物所使用的抗生素种类和使用量不同有关^[1]。

施用有机肥后肥料源args占土壤中arg总量的70%以上^[5]，可以说畜禽粪便是重要的args储存库。在施用不含抗生素的有机肥，也可以显著富集土壤中抗生素抗性微生物和args，其原因是土壤养分的投入改变了土壤微生物群落结构组成，引起含有抗性基因的微生物大量繁殖^[6]。由于抗生素抗性基因在微生物之间的传播与可移动元件密切相关，如在鸡粪中存在大量的转座酶基因，这些转座酶在一定程度上促进了args的水平转移^[7]。在另一项研究中也发现，主要的宽宿主质粒如incp-1和incq在粪便中丰度很高，若在质粒中能检测出args，质粒的多样性能够使args在不同的细菌种属之间进行水平转移^[8]。可以说粪便能刺激args在土壤中的水平转移。总的来说，粪肥的施用会促进土壤中抗性基因的富集和传播^[9]。

2. 研究的基本内容和问题

1.研究目标

目前，已有大量研究阐述不同类型粪肥对土壤args丰度在短时间内变化的影响。然而，重复施用粪肥对抗生素抗性基因年际变化的影响较少，因此本研究则采集了连续3年田间试验的不同施肥处理的土壤样品。通过args的高通量荧光定量pcr和16s rrna基因丰度测定，为揭示施用粪肥、化肥和不施肥处理对土壤args的影响以及探究土壤args在三年重复施用有机肥下是如何变化的。

3. 研究的方法与方案

1.研究方法

1.1．田间试验

田间试验在中国南通市如皋县农业科学研究所（北纬32°22′，东经120°29′）进行。当地土壤由长江冲积土形成，质地为砂壤土。该地区的种植系统以夏季稻－冬小麦轮作为主，夏季稻通常在6月至10月生长，而冬小麦则在次年的11月至5月。田间试验开始于2015年6月，在收获农作物后，将所有农作物秸秆和土壤表面的残留物清除掉，以消除秸秆残留物的影响。

4. 研究创新点

1.研究3年内不同源有机肥施用对土壤ARGs丰度的影响

2.探究了连续施用粪肥条件下，土壤ARGs丰度年际间的变化。

5. 研究计划与进展

2019年7月-9月：取出之前保存的冻干土壤样品，完成不同样品的dna提取工作并进行16s rrna基因测序，同时进行土壤理化性质的测定（2019年7月：学习并了解测序原理，同时学习土壤理化性质测定的实验操作）。

2019年9月-12月：完成args的高通量荧光定量pcr（同时了解pcr扩增的原理和操作，2019年12月完成部分数据的分析）。